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hufan1007鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助 乙酰膽堿酯酶具體的活性測定方法，急，謝謝
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我是這樣測的 用Ellman 法測其活性：乙酰膽堿酯酶0.001g/ml， 底物氯化乙酰膽堿0.01 g/ml DTNB 4 mg/ml （用Tris-甘氨酸緩沖液 ph 8.0 溶解） 取100ul底物加到100ul酶溶液中，反應(yīng)一段時間后加入100ul DTNB ,放置37°反應(yīng)。應(yīng)產(chǎn)生藍色沉淀。但是結(jié)果沒產(chǎn)生藍色沉淀，請問大家這是怎么回事？是不是我實驗步驟有問題啊？ |
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- 性別: GG
- 專業(yè): 化學(xué)反應(yīng)工程
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測定總巰基含量時，15 mg蛋白樣品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 緩沖液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。測定自由巰基含量時，15 mg樣品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 緩沖液中，而后加入50 μL Ellman 試劑 （DTNB, 即5,5-二硫基雙2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 緩沖液，4 mg/mL），在25℃條件下保溫反應(yīng)60 min, 離心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 處測定吸光值，以含Ellman 試劑的Tris-Gly 緩沖液為空白對照。 巰基含量的計算公式如下： SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中：A —除去試劑空白后樣品的吸光度值 D—稀釋倍數(shù) C—樣品濃度（mg/mL） 問題1：上述公式中稀釋倍數(shù)D是怎么算的（具體的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？ 問題2：我測的物質(zhì)為毛發(fā)固體樣品，二硫鍵含量在350μmol/g附近，此種測試方法是否具有可行性 問題3：由于毛發(fā)樣品中含有非水溶性蛋白，又沒喲測量二硫鍵含量的更好的方法 |
2樓2015-10-07 21:12:43
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