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Deng_Cheng鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
原核表達(dá)相關(guān) 已有3人參與
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各位大牛，我在做茶樹AMP脫氨酶的原核表達(dá)，請問： 1. 為了弄清大腸桿菌本身是否含有該酶，我該怎么去做？比如查資料怎么查？ 2.如果大腸桿菌含有該酶，測酶活時(shí)怎么樣做，能確保是原核表達(dá)出來的酶，而不是菌本身含有的酶？ |
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Deng_Cheng
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2樓2015-09-15 17:07:31
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| 不用這么麻煩啊，你如果是想通過原核蛋白表達(dá)純化得到這個(gè)蛋白，給這個(gè)蛋白加上標(biāo)簽就可以了啊。 |
3樓2015-09-16 09:25:04
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【答案】應(yīng)助回帖
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你首先找到你那個(gè)酶的基因序列,然后blast一下,分析一下大腸桿菌里面有沒有?然后再選擇載體,載體上有標(biāo)簽,如28a載體,his標(biāo)簽,純化出來以后,測酶活就行。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2015-09-16 09:30:00
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5樓2015-09-16 10:55:43
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6樓2015-09-16 10:57:14
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7樓2015-09-16 11:29:45
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8樓2015-09-16 11:40:22
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9樓2015-09-17 15:31:41
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必須要純化出來才行，不然結(jié)果不可信。首先破碎液含細(xì)菌總蛋白，一般情況下你隨便往里頭加一個(gè)底物應(yīng)該都會有反應(yīng)；其次你沒有辦法定量總蛋白中目的蛋白的量，假設(shè)一個(gè)檢測體系要加入1U的酶，你無法確定要加多少體積的破碎液，即使你做實(shí)驗(yàn)摸索過要加多少，但破碎液里有蛋白酶之類的會造成其他蛋白降解的成分，放置一兩天后之前摸索的條件就不成立了；再就是每一次實(shí)驗(yàn)得到的破碎液成分都不一樣，假設(shè)第一次實(shí)驗(yàn)破碎液里有A\B\C\D這4種蛋白，含量占總量的25%，那第二次有可能A占30%，B占15%，這種差異使得每次實(shí)驗(yàn)收到的干擾都不同。 |
10樓2015-09-17 16:20:51
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