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qichong木蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
相對(duì)定量qPCR中關(guān)于no RT control的問(wèn)題
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我們的目標(biāo)基因序列是染色體上一段轉(zhuǎn)錄活性較高的區(qū)域，長(zhǎng)度大約有100bp，針對(duì)序列兩端設(shè)計(jì)了引物擴(kuò)增，以核糖體蛋白L37作為內(nèi)參基因。 問(wèn)題是：逆轉(zhuǎn)錄后樣品的靶基因序列CT值是16，no RT control 樣品CT值居然也達(dá)到了20？！ 我開(kāi)始覺(jué)得是DNA污染導(dǎo)致no RT control 樣品CT值過(guò)高，仔細(xì)回顧發(fā)覺(jué)不太可能。 原因是1、trizol提取RNA后測(cè)得OD值為1.9，似乎沒(méi)有DNA、蛋白或有機(jī)溶劑殘留； 2、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒自帶gDNAremover去除基因組DNA反應(yīng)，我們予以采用； 3、逆轉(zhuǎn)錄后樣品的L37 CT值是18，no RT control 樣品L37 CT值是37，從內(nèi)參來(lái)看DNA消化完全。 其它背景：溶解曲線一致、重復(fù)性一致 懇請(qǐng)有經(jīng)驗(yàn)的大神仔細(xì)解答，有可能是什么原因，非常感謝！ |
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