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[求助]
夾心ELISA法，空白顯示，求助��！ 已有8人參與
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最近一直在嘗試建立夾心ELISA法，但是預(yù)實(shí)驗(yàn)就很悲催~單抗用的是自制的小鼠腹水，多抗為自制的兔抗血清，都為純化。用鼠單抗抗包被，兔單抗檢測，結(jié)果加抗原和不加抗原都顯色，而且數(shù)值幾乎沒有差異，但加抗原會高一點(diǎn)點(diǎn)。而包被兔多抗，鼠單抗檢測，結(jié)果都不顯示。重復(fù)了好多次，一開始以為是封閉問題，但換了BSA、酪蛋白和羊血清都顯色�。≌娌恢罏槭裁�，都要瘋了？是因?yàn)闆]有純化嗎？單抗和多抗純度不夠？請大神指導(dǎo)一下��！ 具體的實(shí)驗(yàn)步驟如下： (1)包被：用包被緩沖液將鼠單抗腹水按1:100、 1:200和1:1000稀釋。在酶標(biāo)板反應(yīng)孔中加0.1 mL，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。 (2)封閉：封閉液（3%的酪蛋白）每孔0.2ml，37℃，2h后洗滌。 (3)加樣：加一定濃度稀釋（PBST稀釋）的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(同時(shí)做空白對照)0.1 mL 于上述已包被的反應(yīng)孔中，37℃， 1.5h 。用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。 (4)加檢測抗體：于各反應(yīng)孔中，加入稀釋的兔多抗（PBST按1:200稀釋）0.1ml。37℃，1.5 h，用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min (5)加抗兔IgG-HRP二抗，1:4000稀釋，每孔0.1ml，37℃，1 h，用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min (6)加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入現(xiàn)配的TMB 底物溶液0.05 mL，37 ℃，5 - 15min。（TMB買的） (7)終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入終止液0.05 mL。 (7)結(jié)果判定：將酶標(biāo)板在酶標(biāo)儀上，于450 nm讀數(shù)。 |
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ayiyaya
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3樓2015-09-22 13:58:37
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
liyaid: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 謝謝！今天正好做了包被和不包被，發(fā)現(xiàn)不包被基本不顯色，而包被單抗顯色比較明顯，所以這里是鼠抗問題比較大嗎?主要問題可能是什么呢？這個(gè)鼠抗是不是就不能用了？ 2015-09-22 21:59:38
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
liyaid: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 謝謝！今天正好做了包被和不包被，發(fā)現(xiàn)不包被基本不顯色，而包被單抗顯色比較明顯，所以這里是鼠抗問題比較大嗎?主要問題可能是什么呢？這個(gè)鼠抗是不是就不能用了？ 2015-09-22 21:59:38
| 不包被抗體，直接封閉的板子跟包被抗體，封閉過的板子對照，如果不包被也顯色，是你兔抗的問題多一點(diǎn)，如果不顯色，是你鼠抗的問題多一點(diǎn)，而且包被的時(shí)候都要純化的吧，不然那么多雜蛋白，難免會有非特異性結(jié)合 |
2樓2015-09-22 12:23:11
vivd娟
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4樓2015-09-23 10:41:30
djbitter
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5樓2015-09-24 15:25:50
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