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當(dāng)PACBIO遇到出微生物多樣性16S rDNA全長測序服務(wù)
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16S rDNA基因是細(xì)菌上編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的基因組中。該基因序列足夠長（包含約50個功能域）且具有高度的保守性和特異性。16s rDNA基因檢測技術(shù)已成為病原菌檢測和鑒定的一種強有力工具。隨著數(shù)據(jù)庫的不斷完善，應(yīng)用該技術(shù)可以實現(xiàn)對病原菌進(jìn)行快速、微量、準(zhǔn)確簡便地分類鑒定和檢測。然而，受二代測序的讀長限制，目前的微生物多樣性研究僅檢測16S rDNA的某幾段高變區(qū)，物種分類也只能精確到“屬”的水平。 16s作為鑒定物種分類的“分子鐘”基因，目前采用二代測序雖然可以測其保守區(qū)，但區(qū)分度一直受測序長度影響。而三代平臺的PacBio RS II的平均讀長為10-14Kb，16S rDNA長度大約為1500bp左右，因此結(jié)合該平臺測序可以成功測序獲得16S的全長序列,這樣在微生物鑒定方面注釋信息可靠度會更為精確。 測序原理 首先，Adaptor（SMRTbells）加到擴(kuò)增子的兩端。 然后測序引物與SMRTbells退火。緊接著DNA聚合酶結(jié)合到復(fù)合體上。 隨后聚合酶-擴(kuò)增子-adaptor組成的復(fù)合體被固定到ZMWs中進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生核苷酸特異性的熒光信號。CCS使得聚合酶對環(huán)形鏈進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生具有隨機錯誤的長讀長序列。 運行結(jié)束后，去除接頭（SMRTbell），單分子末端補齊，產(chǎn)生一條序列，CCS測序結(jié)果的單分子覆蓋度和準(zhǔn)確度取決于擴(kuò)增子和序列長度，擴(kuò)增子越小，讀取長度越長，單分子覆蓋度和準(zhǔn)確度就越高。 |
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