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Western Blot科普貼 已有4人參與
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蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）即Western Blot是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是將電泳分離后的細(xì)胞或組織蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物例如硝化纖維（NC）或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，然后通過特異性抗體對(duì)樣品進(jìn)行著色。根據(jù)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。這種方法現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測(cè)和疾病早期診斷（例如：HIV）等多個(gè)方面。 蛋白質(zhì)印跡法繁瑣復(fù)雜，每一個(gè)步驟都有很多需要注意的操作。只有小心翼翼做好每一步，才能保證最終實(shí)驗(yàn)的成功。順利跑完電泳后，印跡法的第一步是轉(zhuǎn)漬，也是重要的開端。因?yàn)槊總�(gè)人的目標(biāo)蛋白不同，所以沒有統(tǒng)一的轉(zhuǎn)漬protocol讓大家使用。轉(zhuǎn)漬的方法選擇、實(shí)驗(yàn)條件和時(shí)間是需要通過實(shí)際經(jīng)驗(yàn)來不斷摸索和總結(jié)的。那么到底怎樣才能確定蛋白質(zhì)被完整轉(zhuǎn)移了呢？小編今兒就給大家講解下轉(zhuǎn)漬過程中一些小技巧，不但可以檢測(cè)轉(zhuǎn)漬效率，也可以讓大家在實(shí)驗(yàn)上少走不必要的彎路。 1. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的完整轉(zhuǎn)移 一定要使用提前染色的蛋白質(zhì)標(biāo)記 （Pre-stained Protein Marker）來監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)樣品的轉(zhuǎn)移。雖然樣品中的蛋白質(zhì)是看不見的，但是如果染色很明顯的標(biāo)準(zhǔn)被成功轉(zhuǎn)移到膜上的話，意味著大部分的樣品也同樣被轉(zhuǎn)移了。有時(shí)雖然分子量很大的蛋白質(zhì)標(biāo)記沒有被轉(zhuǎn)移，大家爺不必太擔(dān)心，因?yàn)槟繕?biāo)蛋白一般都比最大的標(biāo)記分子量小很多，應(yīng)該是被成功轉(zhuǎn)移了的。其實(shí)更值得注意的是轉(zhuǎn)漬時(shí)間不宜過長，否則分子量很小（小于20kDa）的蛋白有可能已經(jīng)從膜的孔隙穿過，附著在濾紙上了。還有一點(diǎn)就是，如果你想在轉(zhuǎn)漬的過程中觀察標(biāo)記轉(zhuǎn)移程度的話，這個(gè)小動(dòng)作很容易引入氣泡，影響轉(zhuǎn)漬效率。所以小編建議大家使用不是很重要的樣品提前做好優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定轉(zhuǎn)漬條件和時(shí)間，再進(jìn)行真正的轉(zhuǎn)漬。 2. 轉(zhuǎn)漬后，把SDS-PAGE的凝膠染色 第二個(gè)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)漬效率的方法就是將凝膠染色，例如Coomassie Stain。這個(gè)方法簡單、便捷，可以清晰地顯現(xiàn)出凝膠上的蛋白質(zhì)含量，從而判斷轉(zhuǎn)漬效率。如果凝膠基本上是透明、干凈的，那么轉(zhuǎn)漬很成功；如果凝膠上還有很多蛋白質(zhì)條帶，證明需要增加轉(zhuǎn)漬時(shí)間。小編在這里提醒一下大家，如果這么做了的話，即使有很多蛋白還在凝膠上，也不能繼續(xù)轉(zhuǎn)移到膜上了，因?yàn)槿旧遣豢赡娴摹Ｋ赃�是建議大家用不是很重要的樣品提前做好優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定轉(zhuǎn)漬條件和時(shí)間，再進(jìn)行真正的轉(zhuǎn)漬。 3. 對(duì)膜進(jìn)行染色 第二條建議雖然好，但畢竟凝膠染色是不可逆的，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度和效率。另外一條建議就是將膜染色。有很多kit是可以成功將膜染色，肉眼就可以辨別出蛋白質(zhì)的位置，而在短短幾分鐘內(nèi)又可以完全將染料去除掉，大家可以放心的進(jìn)行接下來的實(shí)驗(yàn)。這樣一來，就可以很好的檢測(cè)到底有多少蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到膜上。這個(gè)方法也會(huì)讓大家在做接下來的實(shí)驗(yàn)時(shí)更加有自信。 4. 轉(zhuǎn)漬在兩張膜上 上面的方法都是可以鑒定轉(zhuǎn)漬的時(shí)間是否太短。如果大家想檢測(cè)轉(zhuǎn)漬時(shí)間是否設(shè)定的過長，就可以嘗試著放兩張膜，然后進(jìn)行規(guī)范的轉(zhuǎn)漬實(shí)驗(yàn)。如果轉(zhuǎn)漬條件合適，那么大部分的蛋白質(zhì)是應(yīng)該在離凝膠最近的那張膜上；反之，在另外一張膜上也會(huì)檢測(cè)到不少蛋白。如果你的目標(biāo)蛋白的分子量很小，那尤其需要注意。蛋白質(zhì)分子量越小，轉(zhuǎn)漬需要的時(shí)長越短。如果在一張膜上找不到目標(biāo)蛋白，那很有可能已經(jīng)轉(zhuǎn)移到第二張膜上了！ 總結(jié)來看，小編建議大家要依據(jù)自己目標(biāo)蛋白的特點(diǎn)來提前優(yōu)化轉(zhuǎn)漬條件。成功轉(zhuǎn)漬也算是開啟蛋白質(zhì)印跡法成功大門的第一把鑰匙啦！ 文章來源 http://mp.weixin.qq.com/s?__biz= ... isappinstalled=0#rd 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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 蛋白表達(dá)純化與檢測(cè) | 科研之家（食品） |
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2樓2015-11-05 11:07:18
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這個(gè)主要取決于你的轉(zhuǎn)漬方法（wet transfer/semi-dry transfer) 和膜孔隙的大小。孔隙越大，轉(zhuǎn)漬時(shí)間就應(yīng)該越小。 舉個(gè)例子，我通常使用semi-dry transfer， 實(shí)驗(yàn)室里給的standard protocol是轉(zhuǎn)膜一小時(shí)。 但是由于我的目標(biāo)蛋白相對(duì)較小 20kDa, 我適當(dāng)減少到了40-30分鐘，膜孔隙 0.45 和 0.2 微米都試過，轉(zhuǎn)漬效率沒有太大差別，幾乎都能做到complete transfer。 如果你的蛋白在50kDa的話，那么使用0.45微米的膜就可以，semi-dry transfer轉(zhuǎn)漬一小時(shí)左右差不多。wet transfer我做的不多，沒有辦法給你太多建議。 但是無論如何，你都要自己做一些優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，來找到合適的轉(zhuǎn)漬條件。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2015-11-05 20:21:45
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