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tian150685新蟲 (小有名氣)
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[求助]
Gibson Assembly 已有1人參與
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| 我的實(shí)驗(yàn)需要使用Gibson Assembly將線性化的載體和擴(kuò)增后的目的片段進(jìn)行連接，我如果將載體進(jìn)行XhoⅠ單酶切 ，那擴(kuò)增后目的片段設(shè)計(jì)引物的時(shí)候需要加上XhoⅠ酶切位點(diǎn)嗎？ |
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西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2015-10-09 21:26:38
西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2015-10-09 21:26:38
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Gibson Assembly 方法是 Daniel Gibson發(fā)明的將多個(gè)DNA 片段在1 次反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)分子間連接. 此方法關(guān)鍵要求是連接片段與線性化載體首尾有一小段的互補(bǔ)重疊序列. 采用Gibson Assembly 方法僅需要對(duì)載體進(jìn)行單酶切線性化，利用互補(bǔ)DNA 序列可實(shí)現(xiàn)多 段DNA 序列的無縫連接，不需要依賴特定的酶切位點(diǎn)。 1. 設(shè)計(jì)包含片段間20-25 bp 互補(bǔ)重疊序列的引物，通過PCＲ 擴(kuò)增出帶有首尾重疊的目的DNA 片段。（在合成引物時(shí)在特異引物的末端加上載體線性化位點(diǎn)兩側(cè)的序列，而不需要分析目的片段的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)等信息。） 2. 對(duì)載體進(jìn)行單酶切線性化。（本方法只需對(duì)載體進(jìn)行一種限制性內(nèi)切酶酶切，獲得線性化載體，而插入片段不需要進(jìn)行酶切產(chǎn)生相同的黏性末端。） 3. 利用T5 核酸外切酶(T5 exonuclease)的5'→3'外切酶活性產(chǎn)生黏性末端，帶有互補(bǔ)的重序列DNA 配對(duì)。 4. 利用Phusion DNA polymerase補(bǔ)齊片段上的缺口部分。 5. 最后通過Taq DNA Ligase將多個(gè)DNA 片段連接起來。  Gibson Assembly連接體系為10 μL: 載體3 μL，克隆片段1 μL，混合酶6 μL，50 ℃反應(yīng)20 min。 參考資料： 1. Gibson assembly https://en.m.wikipedia.org/wiki/Gibson_assembly 2. 應(yīng)用Gibson Assembly 方法構(gòu)建植物表達(dá)載體 |
2樓2015-10-09 21:02:35
3樓2015-10-09 21:04:14
15623507725
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
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- 專業(yè): 微生物學(xué)
4樓2018-03-19 15:41:05
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