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miRNA
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摘要：微小RNA基因和小的干涉RNA是小RNA的最主要組成部分，它們的相關(guān)性密切，既具有相似性，又具有差異性。它們功能的重要性提示我們基因組非蛋白編碼區(qū)的序列蘊(yùn)含著極為重要的信息。對(duì)小RNA的深入研究將使我們更深一步了解生命的奧秘。 關(guān)鍵詞：小RNA，siRNA，miRNA，非蛋白編碼區(qū) 引言 長(zhǎng)度大小為二十幾個(gè)核苷酸的小片段RNA在近年得到了極大的關(guān)注，這些小RNA中有些可直接調(diào)控某些基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、決定細(xì)胞分化，有些介導(dǎo)特異性反應(yīng)。2003年5月，Steven Buckingham提出的被廣泛認(rèn)同的分類方法中，小RNA（small RNAs）是指非編碼RNA中除轉(zhuǎn)錄RNA（包含核糖體RNA和轉(zhuǎn)移RNA）外的部分，包括微小RNA（Micro RNAs）、小的干涉RNA（short interference RNAs ，siRNA）、核仁小分子RNA和核小RNA（snRNA）�；谧钚碌目蒲谐晒疚膶�(duì)小RNA尤其是siRNA和miRNA的特點(diǎn)、功能、生成過(guò)程以及篩選識(shí)別等進(jìn)行綜述。 1. 小RNA的概況及特點(diǎn) 1.1 siRNA RNA干涉（RNAi）在實(shí)驗(yàn)室中是一種強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)工具，通過(guò)這種方式，利用具有同源性的雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因的沉寂，迅速阻斷基因活性。小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉過(guò)程中人工體外合成的小片段RNA，由約20個(gè)堿基對(duì)組成，包括5個(gè)磷酸鹽，2個(gè)核苷和3個(gè)懸臂。SiRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是對(duì)特定信使RNA（mRNA）進(jìn)行降解的指導(dǎo)要素。1999年, Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次發(fā)現(xiàn)21～25nt 的dsRNA 的出現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因?qū)е禄虺聊种匾?而在轉(zhuǎn)基因正確表達(dá)的植株中則未出現(xiàn)。隨后,Hammond 等進(jìn)行的細(xì)胞提取物核酸酶活性實(shí)驗(yàn)證明了小分子RNA在RNAi 中的作用，這些小分子RNA就是由dsRNA形成的siRNA。siRNA 的3´-末端2-nt 的突出對(duì)靶點(diǎn)識(shí)別的特異性起一定的作用,可將其限定在第一個(gè)堿基對(duì)相鄰的不成對(duì)堿基的位置。最近的《nature》周刊報(bào)道了兩個(gè)研究小組以數(shù)以千計(jì)的人類和老鼠基因?yàn)槟繕?biāo)創(chuàng)建RNAi庫(kù)的進(jìn)展，科學(xué)進(jìn)展已清晰地表明：在哺乳動(dòng)物中利用小的干涉RNA和短發(fā)夾RNA（short hairpin RNAs,shRNA）來(lái)進(jìn)行RNA干涉以使基因沉寂已經(jīng)成為強(qiáng)大而有力的生物工具。 1.2 miRNA miRNA的研究起始于時(shí)序調(diào)控小RNA（stRNAs）。1993年，Lee等在秀麗新小桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegan）中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)可時(shí)序調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因lin-4,2002年，Reinhart等又在線蟲(chóng)C.elegan中發(fā)現(xiàn)第二個(gè)異時(shí)性開(kāi)關(guān)基因let-7，2001年10月《science》報(bào)道了三個(gè)實(shí)驗(yàn)室從線蟲(chóng)、果蠅和人體克隆的幾十個(gè)類似C.elegan的lin-4的小RNA基因，稱為microRNA。MicroRNA（miRNA,微RNA）即為長(zhǎng)度為22nt左右的5´端帶磷酸基團(tuán)、3´端帶羥基的非蛋白編碼的調(diào)控小RNA家族。 植物miRNA從2002年起才有報(bào)道，編碼植物miRNAs的基因明顯不同于其他生物，這樣，植物編碼miRNA基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可能更大，植物的miRNA與互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的錯(cuò)配一般也少于動(dòng)物，所以在進(jìn)化上也更為保守。但和動(dòng)物miRNA一樣，miRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也是發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，在RNaseⅢ酶切后以雙鏈形式存在，最后釋放互補(bǔ)鏈，miRNA成熟。 miRNA廣泛存在于真核生物中，不具有開(kāi)放閱讀框架，不編碼蛋白質(zhì)，一般長(zhǎng)20-24nt，但在擬南芥和煙草中發(fā)現(xiàn)26nt的RNA，四膜蟲(chóng)(Tetrahymenas)中發(fā)現(xiàn)28nt的miRNA。成熟的miRNA 5´端的磷酸基團(tuán)和3´端羥基則是它與相同長(zhǎng)度的功能RNA降解片段的區(qū)分標(biāo)志。 許多miRNA的基因結(jié)構(gòu)及功能在進(jìn)化中有保守性，約12%的miRNA在線蟲(chóng)、果蠅、植物及哺乳動(dòng)物中保守且保守片段的差異僅為1-2nt。在線蟲(chóng)C.elegan中所發(fā)現(xiàn)的miRNA85%都可以在C.briggsar的基因組中找到同源序列。細(xì)胞特異性或組織特異性是miRNA的表達(dá)的主要特點(diǎn)，如擬南芥中的miR-171僅在其花序中高水平表達(dá)，在某些組織低水平表達(dá)，在莖、葉等組織中去無(wú)任何表達(dá)的跡象；又如20-24h的果蠅胚胎提取物中可發(fā)現(xiàn)miR-12,卻找不到miR3-miR6,在成年果蠅中表達(dá)的miR-1和let-7也無(wú)法在果蠅胚胎中表達(dá)，這同時(shí)體現(xiàn)了miRNA的又一特點(diǎn)——基因表達(dá)時(shí)序性。MiRNA表達(dá)的時(shí)序性和組織特異性提示人們miRNA的分布可能決定組織和細(xì)胞的功能特異性，也可能參與了復(fù)雜的基因調(diào)控，對(duì)組織的發(fā)育起重要作用。 1.3其他小RNA 在生物體中，存在一類不同于miRNA和siRNA的小RNA，長(zhǎng)度在20-28nt之間。這類RNA的結(jié)構(gòu)、生成、功能未知。推測(cè)可能來(lái)源于dsRNA兩極，是不同RNaseⅢ酶的產(chǎn)物。 2.小RNA的生成及作用機(jī)制 2.1siRNA的生成及作用機(jī)制 siRNA是RNAi途徑中的中間產(chǎn)物，是RNAi發(fā)揮效應(yīng)所必需的因子。SiRNA的形成主要由Dicer和Rde-1調(diào)控完成。由于RNA 病毒入侵、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄、基因組中反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄等原因,細(xì)胞中出現(xiàn)了dsRNA，Rde-1(RNAi缺陷基因-1)編碼的蛋白質(zhì)識(shí)別外源dsRNA，當(dāng)dsRNA達(dá)到一定量的時(shí)候，Rde-1引導(dǎo)dsRNA與Rde-1編碼的Dicer（Dicer是一種RNaseIII 活性核酸內(nèi)切酶，具有四個(gè)結(jié)構(gòu)域：Argonaute家族的PAZ結(jié)構(gòu)域，III型RNA酶活性區(qū)域，dsRNA結(jié)合區(qū)域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性區(qū)）結(jié)合，形成酶-dsRNA復(fù)合體。在 Dicer酶的作用下，細(xì)胞中的單鏈靶mRNA（與dsRNA具有同源序列）與dsRNA的正義鏈互換，原來(lái)dsRNA中的正義鏈被mRNA代替而從酶-dsRNA復(fù)合物中釋放出來(lái)，然后，在ATP的參與下，細(xì)胞中存在的一種RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體RNA-induced silencing complex （RISC，由核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、解旋酶等構(gòu)成，作用是對(duì)靶mRNA進(jìn)行識(shí)別和切割）利用結(jié)合在其上的核酸內(nèi)切酶的活性來(lái)切割dsRNA上處于原來(lái)正義鏈位置的靶mRNA分子中與dsRNA反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，形成21-23nt的dsRNA小片段，這些小片段即為siRNA。 RNAi干涉的關(guān)鍵步驟是組裝RISC和合成介導(dǎo)特異性反應(yīng)的siRNA蛋白。SiRNA并入RISC中，然后與靶標(biāo)基因編碼區(qū)或UTR區(qū)完全配對(duì)，降解靶標(biāo)基因，因此說(shuō)siRNA只降解與其序列互補(bǔ)配對(duì)的mRNA。其調(diào)控的機(jī)制是通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)而沉默相應(yīng)靶位基因的表達(dá)，所以是一種典型的負(fù)調(diào)控機(jī)制。 siRNA識(shí)別靶序列是有高度特異性的，但這并不是說(shuō)反義鏈上所有的堿基都對(duì)發(fā)揮這種特異性起到了相同的作用。因?yàn)榻到馐紫仍谙鄬?duì)于siRNA來(lái)說(shuō)的中央位置發(fā)生，所以這些中央的堿基位點(diǎn)就顯得極為重要，一旦發(fā)生錯(cuò)配就會(huì)嚴(yán)重抑制RNAi的效應(yīng)，相對(duì)而言，3´末端的核苷酸序列并不要求與靶mRNA完全匹配。 2.2 miRNA的形成及作用機(jī)制 迄今的研究認(rèn)為，miRNA可能的形成及作用機(jī)制為：先由長(zhǎng)的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）生成70nt左右的miRNA前體（pre-miRNA），然后在Dicer酶的作用下使其加工成為一個(gè)不穩(wěn)定的dsRNA分子，接著迅速被降解剪切為22nt左右的單鏈RNA（這種單鏈RNA及以后的miRNA只是Dicer作用下pre-miRNA被剪切的一個(gè)臂，可能是3´端的一個(gè)臂，也可能是5´端的一個(gè)臂，不同RNA可能是同一pre-miRNA的不同臂），之后被PPD(PAZ&Piwi domain)蛋白家族識(shí)別，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體即miRNA核蛋白體（miRNP）,進(jìn)而形成成熟的miRNA。miRNA識(shí)別并與靶標(biāo)基因3´UTR區(qū)部分配對(duì)，從而抑制靶標(biāo)基因的翻譯。 miRNA基因是一類高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分為三種：第一種以線蟲(chóng)lin-4為代表，作用時(shí)與靶標(biāo)基因不完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而阻遏翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性，這種miRNA是目前發(fā)現(xiàn)最多的種類。第二種以擬南芥miR-171為代表，作用時(shí)與靶標(biāo)基因完全互補(bǔ)結(jié)合，作用方式和功能與siRNA非常類似，最后切割靶mRNA,這說(shuō)明某些miRNA和siRNA一樣參與了機(jī)體內(nèi)一些特異性mRNA的剪切過(guò)程。第三種以let-7為代表，它具有以上兩種作用模式，當(dāng)與靶標(biāo)基因完全互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，直接靶向切割mRNA，如果蠅和Hela細(xì)胞中l(wèi)et-7直接介導(dǎo)RISC分裂切割靶mRNA；當(dāng)與靶標(biāo)基因不完全互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，起調(diào)節(jié)基因基因表達(dá)的作用，如線蟲(chóng)中的let-7與靶mRNA3´端非翻譯區(qū)不完全配對(duì)結(jié)合后，阻遏調(diào)節(jié)基因的翻譯。 科學(xué)家們已發(fā)現(xiàn)miRNA在動(dòng)植物早期發(fā)育中起的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，包括植物葉、花的發(fā)生，動(dòng)物胚胎及組織發(fā)育等，Brennecke等人利用電腦尋找靶標(biāo)基因，證實(shí)了miRNA不完全結(jié)合 3´UTR中存在細(xì)胞死亡誘導(dǎo)基因，這提示說(shuō)明miRNA對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行更為重要的調(diào)控作用。同時(shí)，科學(xué)家們也發(fā)現(xiàn)人類基因組中大約有255個(gè)編碼miRNA基因，約占人類基因數(shù)的1%，但尚不清楚其功能。 3. siRNA與miRNA的關(guān)系 siRNA和miRNA在功能和作用機(jī)制上有很大的相似性，但同時(shí)在結(jié)構(gòu)等方面又有很大的區(qū)別，在進(jìn)化上二者的關(guān)系也尚無(wú)結(jié)論。 3.1 miRNA與siRNA的相同點(diǎn) miRNA與siRNA之間有許多相同之處，具體如下： a. 二者的長(zhǎng)度都約在22nt左右。 b. 二者都依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點(diǎn)。 c. 二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。 d. 二者都是RISC組分，所以其功能界限變得不清晰，如二者在介導(dǎo)沉默機(jī)制上有重疊。 e. miRNA和siRNA合成都是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的。 3.2 miRNA與siRNA的不同點(diǎn) a. 二者的根本區(qū)別是miRNA是內(nèi)源的，是生物體的固有因素；而siRNA是人工體外合成的，通過(guò)轉(zhuǎn)染進(jìn)入人體內(nèi)，是RNA干涉的中間產(chǎn)物。 b. 在結(jié)構(gòu)上，miRNA是單鏈RNA，而siRNA是雙鏈RNA。 c. Dicer酶對(duì)二者的加工過(guò)程不同，miRNA是不對(duì)稱加工，miRNA僅是剪切pre-miRNA的一個(gè)側(cè)臂，其他部分降解；而siRNA對(duì)稱地來(lái)源于雙鏈RNA的前體的兩側(cè)臂。 d. 在作用位置上，miRNA主要作用于靶標(biāo)基因3´-UTR區(qū)，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。 e. 在作用方式上，miRNA可抑制靶標(biāo)基因的翻譯，也可以導(dǎo)致靶標(biāo)基因降解，即在轉(zhuǎn)錄水平后和翻譯水平起作用，而siRNA只能導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。 f. miRNA主要在發(fā)育過(guò)程中起作用，調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)，而siRNA不參與生物生長(zhǎng)，是RNAi的產(chǎn)物，原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染。 3.3 miRNA與siRNA的進(jìn)化關(guān)系 miRNA與siRNA在加工機(jī)制上的相似性使二者的界限已經(jīng)越來(lái)越不明顯了。二者在進(jìn)化關(guān)系上是從屬關(guān)系還是平行關(guān)系，它們的進(jìn)化順序是什么，這都引起了生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛爭(zhēng)論，且目前尚無(wú)定論。Hutvagner和Zamore通過(guò)試驗(yàn)，認(rèn)為miRNA或siRNA的功能發(fā)揮取決于它與靶標(biāo)基因結(jié)合位點(diǎn)的匹配程度，而用于識(shí)別miRNA的PPD家族的很多成員為RISC的組分，這樣，二者的界限則更為模糊，它們可能并不存在本質(zhì)的區(qū)別，就此意義上講，siRNA似乎是miRNA的一個(gè)補(bǔ)充。在進(jìn)化順序上，我個(gè)人傾向于miRNA先于siRNA，盡管有些人認(rèn)為外源基因應(yīng)早于生物進(jìn)化出現(xiàn)，但是siRNA是一種干涉RNA的中介產(chǎn)物，它必須有病毒或是其他雙鏈RNA誘導(dǎo)才能形成，且siRNA的阻遏方式過(guò)于徹底，應(yīng)該是生命發(fā)展到一定程度后才產(chǎn)生的。 4.小RNA的識(shí)別、數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)及最新進(jìn)展 在真核生物小RNA基因的計(jì)算機(jī)識(shí)別上，麻省理工學(xué)院的Lim小組開(kāi)發(fā)小RNA基因預(yù)測(cè)程序MiRscan評(píng)分系統(tǒng)，進(jìn)而對(duì)人類和線蟲(chóng)的基因進(jìn)行探索，確定小RNA分屬的家族及保守性質(zhì)。 《nature》周刊近期報(bào)道了在RNA干涉過(guò)程中利用PAZ域?qū)iRNA進(jìn)行識(shí)別，方法是將siRNA的三個(gè)懸臂固定。但是PAZ可能不是在RNA干涉中的唯一識(shí)別方式。 Patrick.J.Paddison等人的兩個(gè)研究小組報(bào)告了以數(shù)以千計(jì)的人類和老鼠為目標(biāo)的RNAi庫(kù)的創(chuàng)建，在哺乳動(dòng)物中對(duì)小RNA的研究將使其有有長(zhǎng)足進(jìn)步。 5月出版的Science報(bào)道了由EB病毒編碼的微RNAi，這是一項(xiàng)全新的發(fā)現(xiàn)。因?yàn)榇蠹抑繰NAi技術(shù)的前提是雙鏈的短RNA，而病毒則是單鏈的DNA/RNA。這一研究成果將為RNAi應(yīng)用提供了更廣闊的前景。 在基因操作較困難的神經(jīng)元中，已有成功進(jìn)行RNAi的報(bào)道。Krichevsky等將化學(xué)合成的21nt siRNA通過(guò)陽(yáng)離子脂類轉(zhuǎn)染試劑導(dǎo)入原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元，顯著抑制內(nèi)源靶基因和轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。抑制神經(jīng)元NO合成酶表達(dá)能有效降低疼痛，在Korneev的實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的雙鏈RNA成功地抑制了中樞神經(jīng)系統(tǒng)NO合成酶表達(dá)，獲得RNA干擾的成功。RNAi能在極低濃度（nmol范圍）siRNA存在下顯示出特殊有效性。 廣東省科技攻關(guān)項(xiàng)目“防治SARS疾病特效siRNA藥物研究”課題組2003年6月開(kāi)始針對(duì)SARS冠狀病毒的RNA基因組特定靶位點(diǎn)自行設(shè)計(jì)了共48條雙鏈RNA小分子，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)成功地篩選出了4條對(duì)SARS冠狀病毒有效的雙鏈RNA小分子，這些雙鏈RNA小分子在體外培養(yǎng)細(xì)胞中能特異地且非常有效地阻斷SARS冠狀病毒的感染及病毒增殖。其預(yù)防SARS冠狀病毒的效果達(dá)到90%以上,幾個(gè)有效的雙鏈RAN小分子聯(lián)合使用其治療效果達(dá)到80%以上，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果均得到重復(fù)驗(yàn)證。經(jīng)過(guò)siRNA預(yù)防或治療后，原來(lái)感染SARS冠狀病毒的綠猴胚腎細(xì)胞多能保持正常的細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目。 5.對(duì)小RNA基因的討論及展望 小RNA的研究給我們帶來(lái)比其本身更為重要的啟示是基因組非組蛋白編碼區(qū)蘊(yùn)含著重要的生命功能活動(dòng)信息。生命的一些重要活動(dòng)如幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞的發(fā)生和分化、神經(jīng)系統(tǒng)的分化等都被一些非蛋白編碼小RNA的調(diào)控；而除miRNA、siRNA以外的小RNA我們更是知之甚少。長(zhǎng)期以來(lái)，分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)都在蛋白編碼基因上，而小RNA的發(fā)現(xiàn)和研究則提示我們應(yīng)該相對(duì)更多地從這方面了解生命的奧秘，這些小RNA可能編碼生命活動(dòng)的重要調(diào)控元件。有報(bào)道稱小RNA可影響四膜蟲(chóng)的細(xì)胞分裂，如果該種小RNA在人類中存在，則可能與癌癥有關(guān)，2004年6月《臨床研究雜志》上發(fā)表的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室研究， siRNA似乎加強(qiáng)了伊馬替尼（Imatinib）和雷帕霉素的抗癌作用。而且據(jù)說(shuō)，這種治療在出現(xiàn)藥物耐受性時(shí)特別有幫助。SiRNA可以通過(guò)與HIV-1細(xì)胞內(nèi)受體CD4，病毒結(jié)構(gòu)蛋白Gag或替代Nef調(diào)節(jié)蛋白的綠色熒光蛋白的靶mRNA作用抑制病毒產(chǎn)生。SiRNA能有效抑制HIV-1生命周期中整合侵染前后事件。這樣，siRNA可能應(yīng)用到HIV-1和其他病毒侵染的治療干預(yù)中。siRNA技術(shù)可能用于抑制HIV-1在宿主細(xì)胞中的復(fù)制的一種可能的治療策略。利用小RNA有效抑制基因表達(dá)的機(jī)理可能為治療很多病毒性疾病和基因疾病尋找新的途徑和突破口。 小RNA還有許多問(wèn)題需要我們?nèi)パ芯浚核鼈兊淖饔脵C(jī)理究竟是什么，具體有什么功能，它們通過(guò)什么途徑識(shí)別靶標(biāo)基因，它們的特異性和時(shí)序性是如何調(diào)控的等等。隨著研究的深入，它將為人類疑難疾病治理等方面起更為深遠(yuǎn)的作用�？傊�，對(duì)小RNA基因的研究將是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，也將是揭示生命奧秘的又一大里程碑。 參考文獻(xiàn) [1]Baulcombe D.ARNA microcosm.Science,2002,297(5589):2002-2003 [2]Calin G A,Dumityu C D,Shimizu M,et al.Small RNAs:the genome′s guiding hand? 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Human RNA silences viral DNA(2005.4.26)
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MicroRNA plays an unexpected role in the process, researchers report in Science | By Charles Q Choi RNA silencing can defend against viruses in humans, French scientists report in this week's Science. Surprisingly, say the scientists, microRNA (miRNA) appears to form the basis of this system. "MiRNAs were thought to be involved in the regulation of endogenous genes, whereas exogenous RNAs, in particular viral RNAs, were thought to be regulated by siRNA [small interfering RNA]," lead author Charles-Henri Lecellier at the Institute of Plant Molecular Biology in Strasbourg, France, told The Scientist. Prior studies have revealed that RNA interference can destroy viruses in plants and insects, but a similar role in vertebrates has not been demonstrated. Since RNA silencing can suppress endogenous retroviruses from mobilizing in plants, yeast, worms, and flies, Lecellier and colleagues reasoned that retrotransposition of mammalian exogenous viruses might also prove vulnerable. They chose as their model system the primate foamy virus type 1, a retrovirus akin to HIV. PFV-1 accumulation in cultured human embryonic kidney cells was strongly enhanced by the expression of the P19 silencing suppressor, suggesting that a siRNA or miRNA pathway limited PFV-1 replication in human cells, because P19 specifically binds to and inactivates both. To identify the target and means of human RNA silencing, the investigators fused viral sequences spanning the PFV-1 genome to a green fluorescent protein (GFP)–tagged reporter gene into constructs cotransfected with PFV-1 into baby hamster kidney cells. Northern and Western analysis revealed GFP levels from construct F11 were disproportionately reduced compared to F11 mRNA accumulation, which reminded researchers of miRNA translational inhibition. The DIANA-microT algorithm revealed a high probability match between the F11 sequence and the human miR-32. Further studies demonstrated miR-32 silencing was suppressed in P19-expressing cells. Also, anti-miR-32 locked nucleic acid oligonucleotide almost doubled progeny virus production, unlike anti-miR-23, suggesting miR-32 has a direct, sequence-specific antiviral effect. In plants and insects, all viruses targeted by RNA interference encode proteins that suppress RNA silencing. Further studies found that in PFV-1, Tas, a viral transactivator, was that protein. In Arabidopsis, transgenic Tas expression strongly decreased siRNAs and led to developmental anomalies reminiscent of those elicited by suppressors interfering with miRNA functions, such as leaf elongation and serration, suggesting Tas suppresses a fundamental step conserved from plants to mammals shared between the miRNA and siRNA pathways. Like Tas, another protein, AC2, encoded by the DNA plant viruses, geminiviruses, is a viral transactivator that can suppress RNA silencing. "We want to investigate whether transactivation and suppression are linked or completely separate," Lecellier said. Researchers currently think each cell type harbors its own specific miRNA repertoire, Lecellier said. "This idea could partially explain some of the differences in viral permissivity observed between specific tissues," he said, with viruses preferentially replicating in cell types where antiviral miRNAs are not expressed or are only weakly expressed. A miRNA response could also lead to the emergence of viral quasispecies, as viruses that can rapidly introduce synonymous mutations into their genomes, such as HIV or influenza, do so to evade silencing by miRNA. "The emergence of quasispecies is important for resistance to antiviral strategies, so studying this miRNA response could be important for studying resistance," Lecellier said. The team saw no evidence that human cells used siRNAs to disable viruses. "So it'd be interesting to investigate whether or not mammals have lost the ability to respond to viruses using siRNAs because they have a more advanced immune system than plants and flies and worms," said Phillip Zamore at the University of Massachusetts, who did not participate in this study. It was uncertain whether the miRNAs were part of a dedicated antiviral response or whether they accidentally silenced viral RNA, he said. "It'd be interesting to see whether expression of miRNAs are vastly upregulated in viral infection," he told The Scientist. Future directions should involve testing any of the several hundred human microRNAs against viruses such as HIV and influenza, said Shou-Wei Ding at the University of California at Riverside, who did not participate in this study. "Also, they studied this in cell culture, and it'd be interesting to look at this at the whole animal level," Ding told The Scientist. Links for this article C. Lecellier et al., "A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells," Science, 308:557-60. April 22, 2005. http://www.sciencemag.org Charles-Henri Lecellier http://www.sigu7.jussieu.fr/B2M/pages/doc/2K4/virord11va.html A.J. Hamilton, D.C. Baulcombe, "A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants," Science, 286:950-2, October 29, 1999. [PubMed Abstract:http://www.biomedcentral.com/pubmed/10542148/] H. Li et al. "Induction and suppression of RNA silencing by an animal virus," Science, 296:1319-21, May 17, 2002. [PubMed Abstract:http://www.biomedcentral.com/pub ... com/pubmed/12016316] C. Lecellier, A. Saib. "Foamy viruses: between retroviruses and pararetroviruses," Virology, 271:1-8, May 25, 2000. [PubMed Abstract:http://www.biomedcentral.com/pub ... com/pubmed/10814564] Phillip Zamore http://www.umassmed.edu/bmp/faculty/zamore.cfm Shou-Wei Ding http://www.cepceb.ucr.edu/members/ding.htm 據(jù)《科學(xué)》雜志4月23日?qǐng)?bào)道，MicroRNA在人體發(fā)育過(guò)程中起著意想不到的作用。 法國(guó)科學(xué)家稱核糖核酸沉默機(jī)制（RNA silencing）能夠抵抗人體中的病毒，不可思議的是，小RNA (miRNA)竟然是組成這一機(jī)制的基礎(chǔ)。 “科學(xué)家一直認(rèn)為miRNA與調(diào)節(jié)內(nèi)源基因有關(guān)，而小分子干擾核糖核酸（iRNA）能夠控制外源基因，尤其是病毒RNA基因，”該文的主要作者、來(lái)自法國(guó)斯特拉斯堡的植物分子生物學(xué)院的查利斯·亨利·萊西利亞在《科學(xué)》雜志上說(shuō)道。 科學(xué)家們先前的研究顯示，核糖核酸干擾（RNAi）能夠消滅植物以及昆蟲(chóng)體內(nèi)的病毒，但目前還沒(méi)有研究表明它在脊椎動(dòng)物也擁有類似功能。自從科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)RNA沉默機(jī)制能夠壓抑內(nèi)生反轉(zhuǎn)錄病毒，使其無(wú)法在植物、酵母、蚯蚓以及蒼蠅等等體內(nèi)游動(dòng)，萊西利亞和他的同事就推斷哺乳動(dòng)物體內(nèi)的外源病毒基因的反轉(zhuǎn)錄移位功能應(yīng)當(dāng)也是同樣脆弱。因此他們選擇了一種原始的1型泡沫病毒（PFV-1）——一種與人體免疫缺損病毒（HIV）同類的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒——作為實(shí)驗(yàn)的模擬系統(tǒng)。 由于P19沉默干擾基因的表達(dá)，PFV-1病毒在人工“人體胚胎腎臟細(xì)胞株”（human embryonic kidney cells）中聚集并且變得十分明顯。這意味著，由于P19細(xì)胞控制著siRNA和miRNA，而且這兩種核糖核酸的路徑也控制著PFV-1在人體細(xì)胞中的繁殖。 為了確定人體RNA沉默機(jī)制的具體作用，研究者們將PFV-1病毒所含有的病毒基因序列與一種附有報(bào)告基因綠色熒光蛋白（GFP）鏈接在一起，然后使它們與人體胚胎腎臟細(xì)胞一起染上病毒。報(bào)告顯示，F(xiàn)11架構(gòu)中的綠色熒光蛋白與F11mRNA聚集中所含有的綠色熒光蛋白比例完全不同。這一點(diǎn)使研究者們想到了miRNA轉(zhuǎn)錄抑制。利用DIANA-microT運(yùn)算法則計(jì)算后發(fā)現(xiàn)F11序列與人體miR-32具有高度的相似性。 進(jìn)一步的研究表明，miR-32沉默受到P19表達(dá)細(xì)胞的壓抑。同樣，受抗miR-32細(xì)胞控制的核酸低聚核苷酸使子代病毒的繁殖量增加了一倍，并不是像抗miR-32細(xì)胞所起的作用一樣。這意味著miR-32起著直接反病毒作用。 植物與昆蟲(chóng)中，所有的核糖核酸干擾（RNAi）能夠消滅的病毒都含有可以抑制核糖核酸沉默的蛋白質(zhì)。而在后來(lái)的研究結(jié)果顯示，PFV-1中含有一種叫做Tas的病毒反激活蛋白。 一種叫做“阿拉伯芥”的植物中，轉(zhuǎn)基因Tas能夠大量減少siRNAs，并且使干擾基因引發(fā)的細(xì)胞產(chǎn)生發(fā)育變異現(xiàn)象，同時(shí)干擾miRNA的功能，例如植物葉子變長(zhǎng)、長(zhǎng)出鋸齒等。這意味著Tas具有抑制miRNA 和siRNA某種基本功能的作用，而這種功能是植物與哺乳動(dòng)物共同擁有的。 類似Tas的另一種蛋白質(zhì)，AC2，其中含有植物基因病毒，也是一種病毒反激活蛋白，同樣能夠壓抑RNA沉默機(jī)制。 目前，研究者們認(rèn)為每種類型的細(xì)胞都有自己獨(dú)有的miRNA細(xì)胞庫(kù)。萊西利亞說(shuō)：“這樣的概念能夠部分解答一些有關(guān)病毒反應(yīng)方面的問(wèn)題�！彼J(rèn)為，在細(xì)胞種類中，優(yōu)先繁殖的病毒是處在抗病毒miRNAs沒(méi)有表現(xiàn)的地方，或者表現(xiàn)并不明顯的地方。 MiRNA的反應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致基因準(zhǔn)種群出現(xiàn)，如果病毒能夠快速使其基因組發(fā)生變異，例如HIV與流感病毒，它就能避免受到miRNA沉默機(jī)制的影響�！盎驕�(zhǔn)種群的出現(xiàn)對(duì)于躲避抗病毒功能的影響是十分重要的，因此研究這種miRNA反應(yīng)也十分重要，” 萊西利亞說(shuō)。 這一研究小組并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)人類細(xì)胞能夠利用siRNA來(lái)消滅病毒�！八匝芯坎溉閯�(dòng)物是用還具有利用siRNA來(lái)對(duì)付病毒的能力是一個(gè)十分有趣的課題，因?yàn)榕c蚯蚓、蒼蠅這些昆蟲(chóng)相比，哺乳動(dòng)物擁有更加先進(jìn)的免疫系統(tǒng)，”麻省理工大學(xué)的飛利浦·賽摩說(shuō)。他并沒(méi)有參加這次研究活動(dòng)。雖然miRNAs是否是抗病毒反應(yīng)的原因之一，或者只是偶然對(duì)病毒核糖核酸起到了沉默作用，但是他認(rèn)為：“不論miRNAs的表達(dá)是否會(huì)抑制病毒傳染，這項(xiàng)研究都會(huì)引起科學(xué)界的廣泛關(guān)注�！� 美國(guó)加州大學(xué)的丁守維（音譯）稱，未來(lái)的研究方向可能會(huì)包括測(cè)試幾百個(gè)人體microRNAs對(duì)諸如HIV病毒和流感病毒等病毒的反應(yīng)，他也未參加此次研究。他說(shuō)：“他們已經(jīng)在細(xì)胞培養(yǎng)室做了試驗(yàn)，如果在動(dòng)物身上做相關(guān)實(shí)驗(yàn)的話會(huì)引起科學(xué)界更大的關(guān)注。” 法國(guó)研究人員發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞能關(guān)閉入侵的病毒。當(dāng)病毒感染細(xì)胞后，它把自己的基因插入細(xì)胞的基因組，這樣在細(xì)胞復(fù)制時(shí)也產(chǎn)生許多的病毒拷貝。研究人員已經(jīng)知道植物和昆蟲(chóng)用RNA干擾使病毒基因沉默，在這個(gè)過(guò)程中，小的RNA分子將自己插入到基因表達(dá)機(jī)器中使某個(gè)基因沉默。動(dòng)物也將RNA干擾用在一個(gè)調(diào)節(jié)功能上：它們?cè)诎l(fā)育過(guò)程中通過(guò)RNA干擾改變自己基因的表達(dá)。Charles Henri Lecellier和同事現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，人類細(xì)胞也用RNA干擾來(lái)阻礙一個(gè)侵襲哺乳類的病毒的積累。 引用鏈接地址：http://www.bioon.com/biology/showarticle.asp?ArticleID=102462 |
5樓2005-06-06 09:17:49
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質(zhì)粒穩(wěn)定性測(cè)試(Plasmid stability test)
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miRNA(金幣+1):總算補(bǔ)充了，請(qǐng)繼續(xù)補(bǔ)充�。�！
miRNA(金幣+1):總算補(bǔ)充了，請(qǐng)繼續(xù)補(bǔ)充�。�！
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Immediately before indcution, it is advisable to test the culture to determine the fraction of cells that still carry the target plasmid. This involves plating of cells on four different plates. Plate cells that grow on these plate LB plate all viable cells LB plate + antibiotic cells that still carry the plasmid LB plate + IPTG (1 mM) cells that have lost the plasmid or mutants that have lost the ability to express the target gene LB plate + antibiotic + IPTG (1 mM) only mutants that retain the plasmid but have lost the ability to express the target gene Remarks In the presence of IPTG, cells carrying a protein production plasmid do not grow because have dedicated all their resources to the production of the recombinant protein instead of cell maintainance. In the presence of the pLysS vector, IPTG also prevents colony formation except with certain vector (such as pET-3 and some vectors carrying the T7lac promoter). In the presence of pLysE, IPTG usually does not prevent colony formation unless the target protein is toxic. In a typical culture useful for producing target protein, almost all cells will form colonies both on the LB plate and on the LB plate + antibiotic; less than 2% of the cells will form a colony on the LB plate + IPTG; and less than 0.01% will form a colony on the LB plate + antibiotic + IPTG. With unstable target plasmids, the fraction of cells that have lost the plasmid will be reflected by an increase in colonies on the LB plate + IPTG and a decrease on ther LB plate + antibiotic. Protocol 1. Immediately before induction with IPTG (at OD600 is approx. 0.6), take a 100-ml aliquot of the cell culture. 2. Make a serial dilution of the cell suspension, including a 105 and 106 dilution. 3. Plate cells at a dilution of 105 on the LB plate + IPTG and on the LB plate + IPTG + antibiotic. Plate cells at a dilution of 106 on the LB plate and on the LB plate + antibiotic. 4. Incubate the plates overnight a 37°C. 5. Count the number of colonies on each plate. Reference: pET System Manual, 8th ed., 1999 (Novagen). |
7樓2005-06-06 09:37:04
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