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眼下在做關(guān)于青枯病的課題 出了問題難以解決 已有3人參與
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本人是大四 本科生 現(xiàn)在在畢業(yè)實(shí)習(xí)階段 老師的課題是關(guān)于云南省煙草青枯病和黑脛病的，我被分到了煙草青枯病這一塊 涉及到分子研究 之前是另外一個實(shí)驗(yàn)室分出來的菌落 引物是自己設(shè)計(jì)的 根據(jù)的是genbank上的GMI1000（許多文獻(xiàn)上用的都是這個基因組的序列）然后老板告訴我 細(xì)菌dna 直接 在菌落上沾一點(diǎn)在體系里面就能跑出來了 然后我就試了一下 結(jié)果沒跑出條帶來 后來自己又用試劑盒提取了一次dna 然后確認(rèn)了里面確實(shí)有dna了 再跑了一次 又沒有跑出來 沒辦法就找了文獻(xiàn)中有的引物 合成了幾對 每個都試了一次 但是結(jié)果出奇的一致：沒有跑出要得條帶反而在的大概在 2000bp和點(diǎn)樣孔中間跑出了一條微微的條帶 當(dāng)然沒有什么卵用 我在想是不是菌出問題了 于是自己分菌 和之前做過青枯菌分菌的人交流了一下 ：在TZC上劃線涂版 會出現(xiàn)兩種菌落一種是大的無規(guī)則的圓形 中間粉紅 邊緣白色 另一種是小的圓形 完全的玫瑰紅色 這應(yīng)該是因?yàn)榫涞闹虏⌒圆町愃?nbsp; 后期小菌落周圍會變黃可能是菌株不純 TZC培養(yǎng)基：10G 蛋白胨 10g 葡萄糖 1g水解絡(luò)蛋白 18g瓊脂 0.05gttc加入5ml無菌水另外高溫殺菌 冷卻后加入 同研究組的另一位老師也親自分了菌給我 加上我自己分出來到的菌 又用特異性引物跑了一次 結(jié)果還是沒跑出來 。。。。。 老板說：你作個16s吧 沒辦法 我就只能用通用引物27f/1492r 序列如下 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG GGTTACCTTGTTACGACTT 跑16s 然后跑出了1500bp的條帶這就說明 dna 也沒問題試劑沒問題 圖片傳不上去 但是確實(shí)在1500那里有明亮條帶 然后把PCR原液拿去一代測序 雙向測序 測序公司告訴我 1492r那里有雙峰 27f正常 每個樣品得到了兩個序列 然后blast duang�。。�！結(jié)果是大腸桿菌 ？？ 老板說你這菌污染了吧 我想想有這個可能 于是再次純化 挑單菌落直接pcr 前后送了十幾個樣品 多次測序 還直接把菌液給試劑公司的人 提取dna 然后結(jié)果出奇的一致 我開始懷疑人生了 然后又聽說云南省的青枯菌 可能不是 勞爾氏菌引起的 而且另一邊實(shí)驗(yàn)室用這個菌去接種煙草也一直沒有接上 同校的以前做青枯菌的許多都不做了 說是接種難 保存難 我覺得自己還是pcr那一塊出了問題 于是就按照文獻(xiàn)的引物 文獻(xiàn)的體系 pcr各個溫度 擴(kuò)增次數(shù) 一點(diǎn)沒變 設(shè)置梯度Mg+濃度 稀釋dna濃度 梯度 也用過mix 體系然后 呵呵 。。。 之前黑脛病的pcr也是我跑的 跑出了特定條帶 所以我覺得pcr技術(shù)這一塊我沒有問題 現(xiàn)在換了一家公司進(jìn)行引物合成 換 759/760那一對 測序也拿到北京去測序 自己一方面要考研 一方面試驗(yàn)只有自己一個人做 有點(diǎn)寢食難安 心力交瘁 希望能在這里得到做過煙草青枯病 分離培養(yǎng) 或者分子方面各位老師的一些指點(diǎn) 在此表示感謝 |
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cugmxl
金蟲 (小有名氣)
植物病理學(xué)
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6樓2016-12-14 08:50:44
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你好 很驚訝現(xiàn)在還有人回我這個帖子 我現(xiàn)在已經(jīng)讀研了 轉(zhuǎn)做根結(jié)線蟲了 在本科做青枯病時候 我后來確實(shí)在分離的菌種找到了青枯病 并且用au759/au760這個青枯病特異引物擴(kuò)增出了特異條帶 我覺得你可以用現(xiàn)有的青枯病特異引物直接做菌落pcr 得到特異條帶以后再做16s 當(dāng)初我就是這么找出來的 致病性很有必要 因?yàn)樗^的青枯病 有時候并不是單指雷爾式菌引起的那個 有些時候會認(rèn)為但凡引起青枯癥狀的病原菌都認(rèn)為是“青枯病菌”因?yàn)橐郧暗腡TC培養(yǎng)基并不是對青枯假單胞的特異 現(xiàn)實(shí)出紅色菌落。 能給出的回答有限 今日在重慶召開了第一屆青枯病大會 不知道你有沒又關(guān)注 希望相關(guān)會議的文集能給你一些思路。 |
7樓2016-12-14 23:34:08
乖乖福
新蟲 (初入文壇)
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8樓2017-06-11 10:16:25
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