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求助鈣轉(zhuǎn)慢病毒包裝與轉(zhuǎn)染經(jīng)驗(yàn) 已有1人參與
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| 各位大神幫幫忙我正在做慢病毒包裝，求經(jīng)驗(yàn)，我用的是三質(zhì)粒系統(tǒng)，怎樣提高慢病毒的包裝效率？謝謝了 |
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kangaroo0513
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2樓2015-10-15 01:29:26
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謝謝你啊，  ，你用的是10ml體系的我用的是小皿，4ml體系，實(shí)驗(yàn)室?guī)熜肿瞿娌《巨D(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率很高，老師給我的protocol，跟他的那個差不多，所以我的一些操作也類似，用的試劑盒也是鈣轉(zhuǎn)的，好像是國外的試劑盒，我的三個質(zhì)粒也是老師給我的，pCMV-dR8.2,VSV-G還有一個目的質(zhì)粒，我抽提的質(zhì)粒目的質(zhì)粒864ng，dr是432，vsv是890 ，我想問一下這三個質(zhì)粒加入各加入多少呀，轉(zhuǎn)染的時候加了喹啉，換液是12小時換一下，再過大概12小時換一下,培養(yǎng)液是2ml然后再24小時后收病毒放在4度冰箱，重新加入2ml培養(yǎng)24小時后再收病毒，把這個病毒跟前天收的病毒一起離心1500轉(zhuǎn)，用它直接轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞了，因?yàn)槲肄D(zhuǎn)染的是白血病細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率能在10%之上，我就可以把它sorting出來了，我的問題是我本身的病毒包裝效率不能達(dá)到70%上所以我的目的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率就很低了，我是實(shí)驗(yàn)小白啦 ，希望大神多多幫助我，第一次在小木蟲上發(fā)帖求助，不知道怎么弄的，看到有人回復(fù)我，我還是挺開心的 |
3樓2015-10-15 10:10:30
kangaroo0513
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摸摸頭，你加我151354061咱倆慢慢詳細(xì)說。。。 話說，載體：dr：vsvg=4:3:1，總量你按照我之前的protocol換算一下。我轉(zhuǎn)然前2h加CQ，轉(zhuǎn)然后12h換液，在之后不換液了，48h收一次，再24h收一次，中間可以4度保存。當(dāng)然，更好的辦法是只收一次，收了就濃縮，然后直接感染。 轉(zhuǎn)然后換液的時候最好加15mM的Hepes（我記得好像是這樣，你再查查濃度）。 另外，轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞的話，好像帶MSCV的病毒載體比較好。最好超速離心一下濃縮。 包慢病毒，我用lentiX293T細(xì)胞，效果比普通293T或者FT效果好很多。 |
4樓2015-10-16 01:17:30
18761615793
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| 轉(zhuǎn)染的話在對數(shù)生長期進(jìn)行，這個時期細(xì)胞最易吸收外源質(zhì)粒，但是不同細(xì)胞有所差異�？匆趺崔D(zhuǎn)染吧，如果是穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選，轉(zhuǎn)染效率15%就夠了，提高轉(zhuǎn)染效率的話，可以適當(dāng)降低轉(zhuǎn)染時細(xì)胞的密度（60～70%的密度比90%好一些），另外還有可能就是細(xì)胞的生長狀態(tài)，還有在接種后24h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 |
5樓2015-11-13 16:44:37
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