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LYforever新蟲 (小有名氣)
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[求助]
關于大腸桿菌同源重組敲除基因的問題——請大家賜教！ 已有5人參與
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| 最近在做大腸桿菌的基因缺失，用的是Red同源重組系統(tǒng)，一次重組已經(jīng)完成，并測序正確，但最近一直卡在二次重組，每次電轉后涂布到A+C的平板上（傍晚），第二天早上就會發(fā)現(xiàn)平板上長一層菌苔，涂布棒涂到的地方整個一片，已經(jīng)重復做了很多次，但還是同樣的問題，一直都不知道問題到底出在哪里，不知道如何是好，懇請前輩們賜教！ |
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【答案】應助回帖
商家已經(jīng)主動聲明此回帖可能含有宣傳內容|
如果在大腸桿菌中做的話，我們成熟的做法是：先轉入pKD46（或類似），然后開始誘導（注意菌株的狀態(tài)，OD，以及阿拉伯糖要新鮮），最后做成感受態(tài)（電轉化，現(xiàn)做現(xiàn)用）。 DNA方面，一般是通過PCR的方法，把抗性基因擴增下來，兩端帶有40nt（或以上）的同源臂（與待敲除基因的兩端同源）。PCR產(chǎn)物一定要經(jīng)過DpnI處理（去除之前的模板質粒），割膠純化，然后elute到ddH2O中。再把DNA電轉化到感受態(tài)中即可篩選。 好像不需要兩次交換（先單交換后雙交換？沒有必要）。如需繼續(xù)交流，歡迎聯(lián)系我們：tolobio@126.com；或者support@tolobio.com www.tolobio.com |
10樓2015-10-19 06:49:45
專吃蟲
銅蟲 (初入文壇)
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【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數(shù) +1
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大腸長得太快了，你不應該過夜的，培養(yǎng)幾個小時就行了，本來涂布就有很多菌了，再長那么快肯定成菌臺了 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2015-10-16 07:29:44
mlanqiang
木蟲之王 (文學泰斗)
藍博士
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3樓2015-10-16 08:10:03
胡亞梅
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9樓2015-10-18 21:53:24
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