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liping121200

銅蟲 (小有名氣)

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3樓: Originally posted by 東樂樂 at 2015-10-19 09:05:11
謝謝你的回答，請(qǐng)問如果做分段克隆的話有什么好的建議嗎？例如酶的推薦和引物設(shè)計(jì)的經(jīng)驗(yàn)?zāi)芊窒硪幌旅�？因�(yàn)闆]有接觸過分段克隆，請(qǐng)多多指教！...

這個(gè)我們實(shí)驗(yàn)室大師兄做的比較多，我知道要這么做，具體的你查查網(wǎng)上的資料吧，我看還挺多的

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好好學(xué)習(xí)，天天向上

11樓2015-10-20 10:57:16

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liping121200

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3樓: Originally posted by 東樂樂 at 2015-10-19 09:05:11
謝謝你的回答，請(qǐng)問如果做分段克隆的話有什么好的建議嗎？例如酶的推薦和引物設(shè)計(jì)的經(jīng)驗(yàn)?zāi)芊窒硪幌旅矗恳驗(yàn)闆]有接觸過分段克隆，請(qǐng)多多指教！...

這是我查到的，感覺蠻好，你看一下，真的要分段，在中間找個(gè)酶切位點(diǎn)分成兩段就好了，每段一千多，也就可以了。再多了實(shí)在沒意義，后面還麻煩。注意這個(gè)酶切位點(diǎn)必須是在這2800bp中只有一個(gè)，而且在酶切位點(diǎn)前后設(shè)計(jì)引物比較容易。

比如說，EcoRI吧，那么P出來的結(jié)果是 5'- XXX......GAATTCXXX，和XXXGAATTCXX.....XXX -3'，然后酶切鏈接測(cè)序去吧。

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東樂樂

好好學(xué)習(xí)，天天向上

12樓2015-10-20 11:02:17

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東樂樂

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5樓: Originally posted by 秉秉的法蘭西 at 2015-10-19 12:07:31
我當(dāng)年也是三千多的片段，很弱，我用kod fx酶，保證性高，p了兩管收集到一起膠回收的，然后二次pcr，不過takara的反轉(zhuǎn)試劑盒的保證性不是特別高，我曾經(jīng)遇到過突變的情況
...

感謝回答！請(qǐng)問逆轉(zhuǎn)錄試劑盒有什么好的推薦么？

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13樓2015-10-21 08:50:04

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6樓: Originally posted by iayala at 2015-10-19 12:10:37
你好，你的問題確實(shí)有點(diǎn)讓你頭疼。我嘗試著分析一下：
1. RNA有沒有斷掉，跑膠看看條帶大小對(duì)不對(duì)驗(yàn)證一下；
2. 模板GC含量是否過高，考慮是否要加DMSO;
3. 嘗試槽式PCR，即設(shè)計(jì)一對(duì)兒引物，其擴(kuò)增片段大小為CDS ...

非常感謝！

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14樓2015-10-21 08:50:51

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7樓: Originally posted by tolobio at 2015-10-19 12:21:37
太長了。很難轉(zhuǎn)錄出這么大量完整的cDNA。還是分成幾段吧。1kb一段，分別PCR，然后再通過無縫拼接的方法克隆到一起。
建議這種體力活還是送到公司來做比較省事。這樣可以省下不少時(shí)間來看文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。
如果需要 ...

非常感謝！

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15樓2015-10-21 08:51:31

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8樓: Originally posted by 董博士 at 2015-10-19 17:43:42
目的片段太長了，超過3Kb就算P出來也容易發(fā)生部分位點(diǎn)突變，這種情況還是建議分段PCR，然后連接，這種原理就是利用粘性末端連接的，每段的引物都設(shè)計(jì)的帶一點(diǎn)下一段的前5-10個(gè)堿基

非常感謝！

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16樓2015-10-21 08:52:03

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12樓: Originally posted by liping121200 at 2015-10-20 11:02:17
這是我查到的，感覺蠻好，你看一下，真的要分段，在中間找個(gè)酶切位點(diǎn)分成兩段就好了，每段一千多，也就可以了。再多了實(shí)在沒意義，后面還麻煩。注意這個(gè)酶切位點(diǎn)必須是在這2800bp中只有一個(gè)，而且在酶切位點(diǎn)前后設(shè) ...

好的，謝謝，我試試看

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17樓2015-10-21 08:53:45

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hikewell

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�？司S爾簡介：
海克維爾基因（北京）研究院是一家專業(yè)從事生物科學(xué)、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)及腫瘤早期診斷研究的科研服務(wù)機(jī)構(gòu)；目前研究院建立了基于基因組學(xué)及細(xì)胞組學(xué)為主的系統(tǒng)生物學(xué)平臺(tái)，配備了包括PacBioRSII 三代測(cè)序儀、Affymetrix 高通量基因芯片、Leica 白激光共聚焦顯微鏡、PE 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)在內(nèi)的領(lǐng)先儀器，可對(duì)外進(jìn)行基因診斷、生化免疫檢測(cè)、大數(shù)據(jù)分析等服務(wù)，為公眾提供癌癥和糖尿病的早期輔助診斷與篩查及慢病精準(zhǔn)化大健康管理服務(wù)。
第三代測(cè)序平臺(tái)簡介-單分子實(shí)時(shí)測(cè)序

PacBio RS II 測(cè)序平臺(tái)介紹
PacBio RS II是Pacific Biosciences公司研發(fā)的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序系統(tǒng)（Single Molecule Real Time, SMRT）。在測(cè)序歷史上首次實(shí)現(xiàn)了人類觀測(cè)單個(gè)DNA聚合酶合成過程的夢(mèng)想。使研究者第一次能夠利用單個(gè) DNA 聚合酶對(duì)天然DNA 的合成進(jìn)行大規(guī)模平行的、連續(xù)的實(shí)時(shí)觀察。它讓科學(xué)家能夠快速經(jīng)濟(jì)地完成基因組組裝、揭示并了解表觀基因組，以及鑒定基因組變異，是基因組從頭測(cè)序的最佳選擇。
PacBio RS II系統(tǒng)的讀長為業(yè)內(nèi)最長，能夠達(dá)到深度覆蓋且精確度高。利用最新的試劑，PacBio RS II的平均讀取長度可達(dá)10 kb-15 kb，且每個(gè)SMRT cell能產(chǎn)生500 Mb-1 Gb的數(shù)據(jù)。在準(zhǔn)確度方面，SMRT DNA測(cè)序可以實(shí)現(xiàn)超過99.999%（QV50）的高度精確測(cè)序，且不受DNA序列中GC和AT含量的影響。這些特點(diǎn)讓用戶可以獲得完整的序列變異類型，檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變異，以及此前無法檢測(cè)到的基因組區(qū)域。此外，SMRT測(cè)序技術(shù)也是目前唯一一個(gè)可以跨越完整基因序列和染色體單倍體型直接檢測(cè)堿基修飾和鑒定變異信息的技術(shù)。
PacBio RS II 測(cè)序系統(tǒng)服務(wù)領(lǐng)域
  基因組測(cè)序
(1) 由于具有讀長長的特點(diǎn)，SMRT測(cè)序平臺(tái)在基因組測(cè)序中能降低測(cè)序后的Contig數(shù)量，明顯減少后續(xù)的基因組拼接和注釋的工作量，節(jié)省大量的時(shí)間。
(2) Pacbio RSII系統(tǒng)提供長片段讀長全面解讀基因組的復(fù)雜度，包括稀有SNP，缺失，結(jié)構(gòu)變異和單倍體等。
長片段讀長對(duì)這些應(yīng)用必不可少，對(duì)有變異的序列如果僅有短片段的讀序會(huì)由于定位錯(cuò)誤或定位不明確而無法確定真實(shí)的變異，甚至得出錯(cuò)誤結(jié)果。此外，短片段讀序也無法測(cè)定大片段的結(jié)構(gòu)變異的準(zhǔn)確位置，大小及等位序列。
  細(xì)菌基因組完成圖
(1) 普通細(xì)菌快速完成圖構(gòu)建；
(2) 尤其適合超高GC/超低GC細(xì)菌；
(3) 其它用傳統(tǒng)方法測(cè)序比較困難細(xì)菌菌株。
該平臺(tái)是目前唯一能完成完整基因組組裝，結(jié)構(gòu)測(cè)定和基因分型的微生物測(cè)序平臺(tái)。實(shí)際應(yīng)用中，大家普遍用PacBio序列拼Contig，再用Illumina的序列來修正堿基，從而將PacBio長讀長數(shù)據(jù)和二代測(cè)序短讀長數(shù)據(jù)進(jìn)行混合拼接完成基因組。
  從頭組裝（DE Novo Assembly）
該平臺(tái)是目前唯一能完成完整基因組組裝，結(jié)構(gòu)測(cè)定和基因分型的微生物測(cè)序平臺(tái)。因?yàn)樽x長很長，所以在拼Contig時(shí)，成功率很高，可以拼出很長的Contig。并且可以輕松跨過重復(fù)序列、高GC序列，實(shí)現(xiàn)序列覆蓋的完整性和均一性。。
  修飾堿基測(cè)定
DNA堿基修飾，例如DNA甲基化，是基因表達(dá)，宿主-病原反應(yīng)，DNA損傷和修復(fù)等許多重要生命過程中的關(guān)鍵因素。與其他技術(shù)相比，PacBio RSII系統(tǒng)能夠?qū)崟r(shí)觀測(cè)到每個(gè)單核苷酸的添加，在測(cè)序過程中同時(shí)檢測(cè)堿基集合的動(dòng)力學(xué)信息，從而直接測(cè)定不同堿基，不同基團(tuán)的多種修飾。
  RNA測(cè)序
單分子測(cè)序技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)，也是最直接的應(yīng)用就是檢測(cè)細(xì)胞和組織內(nèi)基因表達(dá)水平，同時(shí)對(duì)基因的結(jié)構(gòu)做出分析，如RNA的剪接，是否有堿基突變或異常表達(dá)基因等。
  HLA分型
人體器官移植中，準(zhǔn)確的HLA分型很重要。HLA是一個(gè)長片段，而且單體型對(duì)配型成功、移植成功有重要意義�，F(xiàn)在醫(yī)學(xué)上正在嘗試用PacBio的序列來為HLA準(zhǔn)確分型提供解決方案。
PacBio RS II 測(cè)序系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)
完成基因組測(cè)序、靶向測(cè)序、二代測(cè)序數(shù)據(jù)混合拼接、修飾堿基測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組分析等的最佳選擇。
 無以倫比的讀長；
 沒有GC偏好；
 操作流程簡便；
 更精細(xì)的測(cè)序；
 數(shù)據(jù)分析方便；
 獨(dú)有的動(dòng)力學(xué)信息；
PacBio RS II 測(cè)序數(shù)據(jù)分析服務(wù)
針對(duì)PacBio RS II 測(cè)序數(shù)據(jù)我們提供數(shù)據(jù)分析服務(wù)，其中包括原始數(shù)據(jù)的一級(jí)、二級(jí)及三級(jí)分析，可以根據(jù)客戶需求及研究方向，制定“個(gè)性化”的數(shù)據(jù)分析服務(wù)。
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18樓2015-10-21 09:09:20

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jkyy1314

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感覺引物設(shè)計(jì)的不大好，CG含量有些好，就算P出來，特異性也不會(huì)好，CG含量保持在55%以下為宜，還有目的產(chǎn)物確實(shí)太長，我們實(shí)驗(yàn)室也就做幾百b的，也是寶生物試劑盒，效果很好。

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東樂樂

19樓2015-10-21 09:11:47

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zgb1982

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20樓2015-10-21 09:16:23

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