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天宇201266金蟲 (正式寫手)
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[求助]
關(guān)于Hind II 與Xho I酶切連接的問(wèn)題，求大神指導(dǎo) 已有6人參與
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本人做Hind III與Xho I 的雙酶切連接，一直沒(méi)有做成，做了將近5個(gè)月了，自己將近機(jī)關(guān)算盡還是沒(méi)有做出來(lái)，現(xiàn)想各位大神求助。現(xiàn)將自己的情況描述如下，自己通過(guò)PCR擴(kuò)增，來(lái)獲得目的片段510bp，獲得的目的片段兩端5'是Xho I 酶切位點(diǎn)，3'是Hind III酶切位點(diǎn)，而所要連得載體是pET-28a（之前已經(jīng)插入一個(gè)啟動(dòng)子共5610bp），分別用Hind II 與Xho I雙酶切載體與片段， 雙酶切體系是： 目的片段/載體：5 ul 10x M buffer : 1ul Hind III/Xho I : 0.5ul ddH2O ：3ul 酶切之后的膠回收之后的跑膠電泳圖如圖片1 酶切連接之后的單雙酶切驗(yàn)證的體系是： 雙酶切驗(yàn)證 ：質(zhì)粒 ：5 ul Hind III 單酶切驗(yàn)證 ：質(zhì)粒：5 ul Xho I 單酶切驗(yàn)證：質(zhì)粒：5 ul 10x K buffer : 1ul 10x K buffer : 1ul 10x K buffer : 1ul Hind III/Xho I : 0.5ul Hind III : 0.5ul Xho I : 0.5ul ddH2O ：3ul ddH2O ：3.5ul ddH2O ：3.5ul 單雙酶切驗(yàn)證的圖片如圖2和如圖3，圖2與圖3分別對(duì)應(yīng)于同一個(gè)質(zhì)粒。自己做酶切連接跟酶切驗(yàn)證的結(jié)果一直是這樣，求各位大神指導(dǎo)，該如何設(shè)置片段與載體的比例？如何做酶切連接的體系，謝謝！ 圖片1.jpg 圖片2，Hind III 單酶切以及 Hind III +Xho I雙酶切驗(yàn)證，從右向左一次是單雙酶切.jpg 圖片3，Xho I 單酶切以及 Hind III +Xho I雙酶切驗(yàn)證，從左向右一次是雙單酶切.jpg |
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【答案】應(yīng)助回帖
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天宇201266: 金幣+5, ★有幫助 2015-10-17 20:42:56
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這個(gè)兩個(gè)酶切位點(diǎn)應(yīng)該是很好切，也好連。樓主做的時(shí)候一定要注意幾點(diǎn)： 1.你PCR產(chǎn)物兩端要各加3個(gè)保護(hù)堿基，一般HindIII加GGG，XhoI加CGG堿基，可以參考有關(guān)文獻(xiàn)；這樣才能保證酶能將PCR產(chǎn)物末端切開； 2.酶切體系中DNA量及酶切時(shí)間。PCR產(chǎn)物及載體量不宜過(guò)多，酶切時(shí)間要足夠，現(xiàn)在快切酶10～15分鐘可以切好，但還是建議切30分鐘以上，載體可以切2h，酶切完全是試驗(yàn)成功的第一步。 3.一般來(lái)說(shuō)載體和DNA片段1：3（摩爾比）連接效果比較好。一般情況下，由于載體堿基比DNA片段多2～3倍，從DNA電泳圖看，載體和DNA亮度一樣的量基本合適。 |
9樓2015-10-17 09:27:11
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本帖內(nèi)容被屏蔽 |
4樓2015-10-16 18:36:10
【答案】應(yīng)助回帖
★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
天宇201266: 金幣+1, ★有幫助 2015-10-20 20:12:20
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天宇201266: 金幣+1, ★有幫助 2015-10-20 20:12:20
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每次批量操作10個(gè)載體的經(jīng)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，片段和載體比例不是重要的。要點(diǎn)是酶切徹底，回收試劑盒好，回收電泳要換新的電泳也。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2015-10-16 23:36:18
13樓2015-10-19 16:54:43
【答案】應(yīng)助回帖
商家已經(jīng)主動(dòng)聲明此回帖可能含有宣傳內(nèi)容
★
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myprayer: 請(qǐng)勿刷應(yīng)助指數(shù)，已經(jīng)看到您很多次無(wú)用的應(yīng)助了。謝謝你的理解與配合。 2015-10-16 20:21:18
天宇201266: 金幣+1, 老板不會(huì)同意的 2015-10-17 20:41:23
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建議還是送到公司來(lái)做吧，比較省事，價(jià)格也不貴，做不出還不收費(fèi)：http://www.tolobio.com/service_detail.php?id=110 相親咨詢：support@tolobio.com |
2樓2015-10-16 15:39:15
wxb2061
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3樓2015-10-16 18:19:36
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5樓2015-10-16 23:24:25
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6樓2015-10-16 23:25:54
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8樓2015-10-17 00:01:29
10樓2015-10-18 16:02:47
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