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環(huán)狀RNA相關(guān)問題！
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1.環(huán)狀RNA的引物設(shè)計及所用軟件； 2. 環(huán)狀RNA的siRNA設(shè)計； 3. 環(huán)狀RNA過表達載體構(gòu)建 |
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2樓2015-10-18 12:21:29
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【答案】應(yīng)助回帖
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酣睡未起: 金幣+10, 博學(xué)EPI+1 2015-10-18 20:54:55
酣睡未起: 金幣+10, 博學(xué)EPI+1 2015-10-18 20:54:55
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吉賽生物研發(fā)了兩款含雙酶切位點的環(huán)狀RNA過表達載體，直接通過酶切連接插入目的環(huán)狀RNA片段，并保證插入的環(huán)狀RNA目的片段在細胞內(nèi)正確環(huán)化和高效表達。pcD-ciR表達框架中間插入KpnI和BamHI酶切位點，慢病毒表達載體pLO-ciR表達框架中間插入EcoRI和NdeI酶切位點，可以滿足瞬時表達和穩(wěn)定表達不同需求。 構(gòu)建流程: 1、環(huán)狀RNA線性序列PCR擴增 2、直接連接到過表達載體 3、細胞內(nèi)RNA剪接形成環(huán)狀 4、特異性準(zhǔn)確表達 |
3樓2015-10-18 15:08:42
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【答案】應(yīng)助回帖
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酣睡未起: 金幣+20 2015-10-18 20:55:04
酣睡未起: 金幣+20 2015-10-18 20:55:04
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這篇文章是研究環(huán)狀RNA的，相關(guān)的方法你可以參考一下，希望對你有所幫助。引物設(shè)計軟件的話用primer 5.0應(yīng)該是可以的。 siRNA設(shè)計大都根據(jù)Tuschl的實驗，要點如下： 1.目標(biāo)基因開放閱讀框起始密碼下游75至100堿基位置開始，尋找“AA”二連序列后的19個堿基序列。（用非“AA”的“XY”序列后的19個堿基序列同樣可以得到很好效果的siRNA）。 設(shè)計siRNA時不要針對5’和3’端的非編碼區(qū)。 2.分析獲得的序列，選擇GC比在40-55%之間的靶基因序列作為優(yōu)選。 3.將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST等。 4.如果選擇shRNA，有報道顯示9個寡核苷酸的環(huán)是最有效的。 下面是另一個設(shè)計的版本，大致相同： 1. 從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3’端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為效。Tuschl等建議在設(shè)計siRNA時不要針對5’和3’端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。 2. 將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST 3. 選出合適的目標(biāo)序列進行合成。通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 負對照 一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有負對照，作為負對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。 如果計劃合成siRNA，那么可以直接提供以AA打頭的21個堿基序列，廠家會合成一對互補的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3’dTdT結(jié)尾，如果要UU結(jié)尾的話通常要特別說明。有結(jié)果顯示，UU結(jié)尾和dTdT結(jié)尾的siRNA在效果上沒有區(qū)別。因為這個突出端無需和靶序列互補。 現(xiàn)在Qiagen公司的網(wǎng)站上有完整的siRNA 的設(shè)計方法，可以自動設(shè)計并生成多個備選序列，并且可以自動連接到基因組數(shù)據(jù)庫進行檢索比對。 |
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2015-10-18 15:10:23, 14.03 M
4樓2015-10-18 15:16:29
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5樓2015-10-18 15:20:50
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