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小小八八鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
基因敲除第一步同源重組后用上下游基因的兩頭引物同時(shí)擴(kuò)增怎么只出現(xiàn)了一個(gè)條帶 已有2人參與
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 終于把基因組上缺失目地基因的上下游片段融合到一起了且連到敲除載體上，再把構(gòu)建好的敲除載體導(dǎo)入我們的宿主菌，現(xiàn)在問題來了：我們用的是兩次同源重組的方法進(jìn)行敲除的，第一輪同源重組后我用相應(yīng)的抗性平板篩選到了照理說質(zhì)粒整合到基因組上的轉(zhuǎn)化子，提了轉(zhuǎn)化子的基因組后然后我用我缺失了目地基因而融合在一起的上下游片段的兩個(gè)外端的引物，可是p出來的條帶只有少了目地片段的上下游基因的長(zhǎng)度（大概2000左右），而沒有上游引物+目地基因+下游基因的那個(gè)片段（大概2600左右），但是我的原始宿主菌的對(duì)照，它是可以p出2600這個(gè)全長(zhǎng)的片段，這說明了什么？第一輪同源重組有沒有成功？ 1，如果成功了，為什么用上下游基因的上下游引物p，應(yīng)該p出兩條帶，卻只能p出一條帶； 2，考慮到有可能目地基因已經(jīng)敲除成功，昨天我把我從抗性平板上挑的基因提了基因組，p我的目地基因，結(jié)果目地基因能p出來，說明敲除沒有成功，那么為什么我用上下游基因的引物p，p不出這個(gè)帶有目地基因的全長(zhǎng)片段？ 以上，請(qǐng)問蟲友們做敲除的有沒有遇到這種情況，有什么辦法可以確定我的菌已經(jīng)進(jìn)行了第一次同源重組呢？ |
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小小八八
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6樓2018-11-07 16:14:59
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