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[求助]
請各位大神木蟲幫我分析一下WB條帶 已有2人參與
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請各位大神木蟲幫我分析WB條帶 圖1 和圖2分別是目的蛋白，圖3 是GADPH。我解釋一下，一抗孵育過夜，然后急著發(fā)光看結(jié)果，就一抗洗了4次，5min／次。二抗孵育1h。二抗洗3次， 5min／次。發(fā)現(xiàn)目的蛋白背景太黑了。是不是也是一抗特異性不強的緣故��？ 多謝各位蟲子，虛心請教。 屏幕快照 2015-11-03 下午10.29.45.png 屏幕快照 2015-11-03 下午10.29.52.png 屏幕快照 2015-11-03 下午10.31.13.png |
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封閉液用的是什么？脫脂奶粉效果比BSA稍好。 一抗的稀釋比例和孵育時間都可以調(diào)整一下試試。另外，二抗的孵育時間也可以縮短為30到40分鐘試試。 曝光時間也可以縮短。 好的結(jié)果都是要不斷優(yōu)化實驗條件的。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2015-11-03 23:05:08
3樓2015-11-04 13:01:15
keke226
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【答案】應(yīng)助回帖
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過夜是在4℃嗎？可以試試一抗稀釋到1比1500或2000，一抗?jié)舛鹊鸵恍⿻档鸵恍┓翘禺愇降摹?br /> 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
蛋白小王子64樓2015-11-04 13:07:32
5樓2015-11-04 13:38:37
liweiwaxmc
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封閉不完整會增加背景！封閉液用的不好，一抗有可能非特異性結(jié)合，背景增加！稀釋一抗對降低背景有一定效果！重點看一下封閉步驟和一抗特異性！ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
6樓2015-11-04 21:57:44
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你好 多謝你的建議，因為內(nèi)參和目的蛋白是在同一張膜上孵育的，內(nèi)參沒有問題，說明封閉應(yīng)該不會太差。第二點我挺贊成的。就是一抗可能濃度太高。染了非特異性條帶。今天下午和同學(xué)討論了下，他說可能是我的洗膜時間太短了。我記著開組會。一抗 二抗平均洗了3次 每次5min。然后我同學(xué)說他洗4-5次 每次10min。 我覺得這個也有關(guān)系，謝謝你。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
7樓2015-11-04 23:47:46
liweiwaxmc
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8樓2015-11-05 00:15:20
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我這兒也是失敗案例，同樣一抗稀釋1000倍，4℃結(jié)合過夜，但回收重復(fù)使用三次。封閉一抗二抗都是用TBST5min/次，重復(fù)6次放搖床洗滌。曝光時間10-30都用過，不知道這里是否有問題。敢問樓主曝光多久？我這做出來背景深到整個片子一泡污，焦急分析步驟中…… 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2015-11-12 13:39:48
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收到 先回答你曝光時間的問題 GA的話表達高 曝光10s內(nèi)足夠了，磷酸化的蛋白我最久的曝光了7分鐘。 背景值的問題我感覺和搖床洗膜也有關(guān)系，要使勁搖，讓膜晃起來。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
10樓2015-11-12 13:56:43
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