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大窩窩隨風(fēng)新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助，搭橋pcr
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我現(xiàn)在要搭兩個(gè)前段，一個(gè)是2.3kb一個(gè)是2.4kb，有點(diǎn)長，現(xiàn)在搭橋搭不出來。 第一，因?yàn)槲覀兪侵虚g定點(diǎn)突變的，所以只能從這兒分。我們之前已經(jīng)用我們的酶順利p出了全長，所以肯定不是酶的問題了。 第二，中間大約有24個(gè)重復(fù)堿基，長度應(yīng)該也夠了。 第三，我們p兩段的時(shí)候，還是很順利的，也很單一。只是pcr大量的時(shí)候，我先點(diǎn)2微升檢測，大小正確，然后把其余的一百多微升一起點(diǎn)往后，條帶大小變小了。因此膠回收后，我又點(diǎn)樣檢測大小，還是正確的。所以應(yīng)該排除前兩段的問題了。 第四，我用了兩種方法進(jìn)行搭橋，一種是先延伸，就是不加兩端引物，p20個(gè)循環(huán)，后加入引物繼續(xù)p25個(gè)循環(huán)。這是我們實(shí)驗(yàn)室的傳統(tǒng)方法，但是我沒有得到目的條帶。我也進(jìn)行了溫度梯度pcr，均小于兩端引物和中間重復(fù)區(qū)域的TM值。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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2樓2015-11-05 08:58:41
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兩段引物，我都是加的1:1比例，因?yàn)榱炼炔畈欢唷Ｖ?0微升體系我加了0.5微升，也加過0.3微升的。 現(xiàn)在就是只有雜帶，沒有目的條帶。該怎么辦？我已經(jīng)不知道該咋辦了？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2015-11-05 08:59:31
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4樓2015-11-05 09:00:00
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