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mcxiaomu1023鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
雙酶切鑒定，為什么找不到所需要的目的條帶？
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請(qǐng)各位實(shí)驗(yàn)大神救小弟于水深火熱之中。。。 我現(xiàn)在的課題是做RNA干擾方面的實(shí)驗(yàn)，從網(wǎng)上設(shè)計(jì)的siRNA，然后根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)了65bp長(zhǎng)度的shRNA，前后分別加了HindIII和BamHI的酶切位點(diǎn)，所用的質(zhì)粒是psilencer2.1-U6，我需要把這個(gè)65bp的片段插入質(zhì)粒中，但是由于shRNA特有的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，不能通過常規(guī)大測(cè)序來判斷是否成功插入了目的片段，所以只能通過雙酶切鑒定來大體看一下。但是問題就出在這，我做了好幾次，質(zhì)粒也重新提取重新酶切連接了好幾次，但是總是看不到65bp大小大條帶，只能看到質(zhì)粒的條帶。附上圖： 所用的酶是NEB的 HindIII-HF 和 BamHI-HF，根據(jù)說明書兩酶可以一起37℃酶切15分鐘即可（我也試過更長(zhǎng)時(shí)間酶切）； 所用的膠是2%的，marker是20bp的ladder，100V跑30分鐘左右（有人告訴我可能目的片段太小跑出膠去了，我也試過90V跑20分鐘，但始終看不到65bp的條帶）。 求各位同仁老師或者師兄師姐幫助啊，我的步驟哪里出了問題？有沒有其他方法鑒定目的片段是否插入了？萬分感謝！ 11002.jpg 2014053079.jpg |
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mcxiaomu1023
鐵蟲 (初入文壇)
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7樓2015-11-09 08:04:55
2樓2015-11-06 22:27:25
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-02-21 22:31:13
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-02-21 22:31:13
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片段太小了，發(fā)卡結(jié)構(gòu)也是可以測(cè)序的，測(cè)序的時(shí)候告訴他們存在特殊發(fā)卡結(jié)構(gòu)，之前我做的一個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)測(cè)序完全正確，去測(cè)序吧 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2015-11-06 22:31:59
嗜血的貓咪
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4樓2015-11-08 18:04:24
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