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[求助]
天啊，長(zhǎng)得全是白斑，沒(méi)有藍(lán)斑？藍(lán)白斑篩選問(wèn)題求助 已有7人參與
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這兩天做藍(lán)白斑篩選，新手第一次做，今天觀察平板時(shí)發(fā)現(xiàn)涂的10個(gè)板全部都是只長(zhǎng)了白斑，一個(gè)藍(lán)斑都沒(méi)有看到？這是神馬情況—————— 我先說(shuō)下我做的過(guò)程，大神看看是不是哪里出了問(wèn)題： 連接：切膠回收后我檢測(cè)了回收的DNA后，開(kāi)始做的轉(zhuǎn)化，連接用的是takara公司的18T載體，按照說(shuō)明做成10ul體系，連接了6小時(shí)，（我的目的片段在1000bp以下，說(shuō)明書(shū)上寫(xiě)只需30分鐘）。 轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化用的takara公司的DH5α感受態(tài)細(xì)胞50ul和10ul的連接產(chǎn)物，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作，并加入500ul的soc培養(yǎng)基，混勻，37℃揺菌1小時(shí)。 涂板：我在每個(gè)板上涂了50mg/ml的IPTG20ul，20mg/ml的x-gal45ul（藥品都是上周剛配的，x-gal也用錫箔紙包裹了），涂勻，蓋上蓋子，倒置超凈臺(tái)，關(guān)燈，放置一會(huì)兒。然后揺菌結(jié)束，菌液4000轉(zhuǎn)，離心2-3min，棄上清，剩300ul左右菌液，平均涂到了2個(gè)處理過(guò)的平板上，封好后倒置與37℃恒溫箱過(guò)夜培養(yǎng)。 下邊這張圖是培養(yǎng)了12小時(shí)左右拍的，10個(gè)板子全是只長(zhǎng)白斑，一個(gè)藍(lán)斑都沒(méi)有。于是做了如下處理： 1.選2個(gè)板子37℃繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，菌變大了，但是還是沒(méi)有藍(lán)色。 2.選8個(gè)放進(jìn)了4℃冰箱，希望能抑制生長(zhǎng)，另外看看能不能出現(xiàn)藍(lán)斑，可是三四個(gè)小時(shí)后，還是沒(méi)有出現(xiàn)藍(lán)斑!!! 怎么破�。看笊駛�！看長(zhǎng)出來(lái)的情況應(yīng)該是我涂的菌液太多了，我操作過(guò)程有沒(méi)有問(wèn)題�。渴裁辞闆r導(dǎo)致了全白無(wú)藍(lán)？藍(lán)色顯色很難嗎？ IMG20151115101026.jpg |
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gzbjzjchen
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4樓2015-11-15 18:21:09
gzbjzjchen
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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因?yàn)檗D(zhuǎn)化效率高，隨便挑那個(gè)菌都可以用 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
wcq吳超群2樓2015-11-15 18:15:56
3樓2015-11-15 18:18:51
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你的意思是我直接挑白色單菌落，菌液pcr，有目的條帶的，送去測(cè)序？我pcr出來(lái)的不是單一基因序列，用的通用引物，目的基因長(zhǎng)度也不一張，之所以做克隆，就是為了盡可能篩選分離開(kāi)這些不同序列。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
5樓2015-11-15 18:25:56
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