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218854055銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
救急，3RACE老是沒(méi)有目前條帶 已有2人參與
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實(shí)驗(yàn)論文需要做RACE克隆全長(zhǎng)，現(xiàn)在做了3’RACE就做了好久，老是做不出來(lái)。 簡(jiǎn)單說(shuō)下自己試驗(yàn)流程：我用的是5‘/3’ RACE Kit，2 and Generation盒子。實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕虻钠问菑幕蛐酒系玫搅�，前期做了一些預(yù)備工作，發(fā)現(xiàn)該序列是多基因家族。因?yàn)樵谠O(shè)計(jì)引物的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)從該片段設(shè)計(jì)出來(lái)兩對(duì)引物（A3/A5、B3/B5）擴(kuò)增的產(chǎn)物并不是完全有重疊區(qū)，本來(lái)A3/A5前面一段的序列應(yīng)該全部與B3/B5尾部重疊的，但是B3/B5尾部序列和A3/A5前面序列只有一段是100%相同，后面有較大的差異，把兩個(gè)片段Blast與目的基因同源性覆蓋率是不同。故此認(rèn)為這個(gè)基因是多家族基因（不正之處望蟲友指正）。 所以我拿了和目的基因覆蓋率最高，同源性最好的引物A3/A5做后面的實(shí)驗(yàn)。3‘RACE我用了A3(也就是RNA的正義引物)，按照盒子cDNA反轉(zhuǎn)錄，55℃60分鐘孵化，80℃滅活。 后面用了盒子推薦的Expand High Fidelity PCR System，我的A3引物引物制作公司給的TM是64℃，CG含量56%，PCR程序自己定的：94℃ 30s，72℃ 2min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，70℃ 30s，72℃ 2min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min；72℃ 7min。（PS我是不是要按盒子推薦的程序呢？因?yàn)閯e人說(shuō)不要按盒子程序設(shè)置）每次做結(jié)果都不一樣，要么很多非特異性條帶，要么片段太小，要么彌散。不知道問(wèn)題出在哪？求問(wèn)，急！ |
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新蟲 (正式寫手)
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2樓2015-12-27 15:28:51
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銀蟲 (小有名氣)
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3樓2015-12-27 17:50:20
4樓2016-04-01 22:31:26
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