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tonyde新蟲 (初入文壇)
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[求助]
構(gòu)建RNAi植物表達(dá)載體，連接多次失敗，向各位前輩求助！ 已有2人參與
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構(gòu)建RNAi植物表達(dá)載體，連接多次失敗，我把遇到的情況列了一下，希望有經(jīng)驗前輩們幫忙分析一下原因！ 1.目的片段（一個基因的正向片段加內(nèi)含子加反向片段）之前已經(jīng)連到中間載體上了，目的片段大小為1200bp，植物表達(dá)載體11600bp 2.酶切位點(diǎn)用的是Apa I和BamH I 3.連接體系10uL和20uL都試過，載體和片段比例從1:6到1:10也都試過，T4連接酶是NEB的 4.連了好幾次，一開始板上不長菌，后來長菌了，菌液PCR也有帶，提質(zhì)粒大小竟然是4000bp左右（真是神奇），用Apa I和BamH I切后有兩條帶，一條900bp左右，一條1100-1200bp左右（更神奇了  ）。再后來還有一種情況，板上長菌，提出質(zhì)粒后大小12000bp左右（大小是對的），但是提質(zhì)粒，質(zhì)粒PCR全都沒有帶。5.已發(fā)現(xiàn)的問題： 表達(dá)載體用Apa I單酶切的時候會切下來一條2000bp左右的帶（但是載體圖譜里只有一個Apa I酶切位點(diǎn)），這個載體是向其他實驗室要的，他們之前做過跟我一樣的實驗（酶切位點(diǎn)都一樣，只有基因不一樣），但是他們的論文里沒說這個載體有2個Apa I位點(diǎn)啊！ 各位大神們，提出質(zhì)粒4000bp是怎么回事？連的不對是不是我的表達(dá)載體有問題啊？ |
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2樓2015-12-10 20:10:58
3樓2016-03-14 16:20:23
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