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stcarlos鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
請(qǐng)教siRNA的幾個(gè)疑問，多謝各位高手！
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各位高手大家好！ 在下才疏學(xué)淺，有幾個(gè)RNA干擾方面的問題水平不高，但卻是我急需了解的，所以懇請(qǐng)大家指導(dǎo)了，先謝謝大家！ 首先，我在百度上搜索到有關(guān)siRNA的簡(jiǎn)介，有5種siRNA，其中三種是體外制備的（化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、用RNase III 消化長(zhǎng)片斷雙鏈RNA制備siRNA），兩種是體內(nèi)表達(dá)的（siRNA表達(dá)載體、siRNA表達(dá)框架）。在干擾目的細(xì)胞的RNA時(shí)，前三種體外制備的siRNA好像是不需要表達(dá)載體及啟動(dòng)子的，后兩種體內(nèi)表達(dá)的siRNA則需要啟動(dòng)子。 然后，在下擬針對(duì)Mig-7基因進(jìn)行RNA干擾，并查到幾篇參考文獻(xiàn)如下： 1、中文文獻(xiàn)里面這樣描述siRNA： 設(shè)計(jì)3 對(duì)針對(duì)Mig-7mRNA序列的siRNA 序列，靶序列分別為 1: 5'-CAACACAGCTTGAGTGGAA-3';（cDNA的第1233位bp起始） 2: 5'-CTATAGACTCTGAGCAAGA-3'; （cDNA的第1314位bp起始） 3: 5'-CTTCAAAGGTTCTTAAAGT-3'。（cDNA的第1376位bp起始） 該文獻(xiàn)中的3條單鏈用的是LipofectamineTM 2000 Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒，應(yīng)該屬于體外制備的siRNA吧？只需要脂質(zhì)體試劑盒轉(zhuǎn)染就行了吧？還存在啟動(dòng)子再轉(zhuǎn)錄的問題嗎？ 2、Cancer Research的文章里面這樣描述siRNA： The sequences of the MIG7-1 siRNA and MIG7-2 siRNA are: GUCGAAGAAAUGAAACUUUUU and CUUAAAUCACAGGAAAUCUUU. (1)、為什么Cancer Research文章里面siRNA末尾有連續(xù)幾個(gè)U，而中文文獻(xiàn)卻沒有？ (2)、siRNA序列中到底使用T還是U？ (3)、為什么Cancer Research文章里面siRNA得序列與該基因的cDNA序列（見后附）中的任意一段都匹配不上呢？ (4)、“Cancer Research文章”里面的siRNA，用的是Dharmacon Accell SMARTpool siRNA reagent (Thermo FisherScientific)，這算是體外制備的siRNA還是“基于PCR的表達(dá)框架”的siRNA呢？如果是前者，只需要脂質(zhì)體試劑盒轉(zhuǎn)染就行了吧？還存在啟動(dòng)子再轉(zhuǎn)錄的問題嗎？有人認(rèn)為“Cancer Research文章”里面的siRNA 應(yīng)該使用的是哺乳動(dòng)物RNA pol3啟動(dòng)子，這兩條單鏈RNA是互補(bǔ)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)后，結(jié)合到pol3啟動(dòng)子的下游，從而產(chǎn)生作用。所以看起來并不多互補(bǔ)配對(duì)的，因?yàn)槭前l(fā)卡結(jié)構(gòu)的。各位覺得對(duì)嗎？ 多謝各位高手了！ 該基因的cDNA序列如下： LOCUS DQ080207 1617 bp mRNA linear PRI 26-MAY-2006 DEFINITION Homo sapiens MIG7 (MIG7) mRNA, complete cds. ACCESSION DQ080207 VERSION DQ080207.2 GI:102863545 KEYWORDS . SOURCE Homo sapiens (human) ORGANISM Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; ORIGIN 1 gtgcctctct atggagagca cctctgtggc ctctctgaga gcactcacag ccaaaagtac 61 acagctgccc ccaggctgag agtgcttgat acacccttga atcccctctt atatgatgcc 121 ccagcccagg agagataaaa gcatcagcac catgagattc acctgcctct ggtcgttagg 181 gaacaatgga ggcctgcgat tggagttaaa ctctcagtga tctctgtgtt gacaacacca 241 aagctagagg aatccagtag gatgtgggca tggttttccc ggaaggctga ctgagcagtt 301 ctgcaaatgt ttgcaagtac agggcagaat ttcatccagc ctcagaacct tgagccaaga 361 ctcagcatca gcaaagccaa aagtttcatt tcttcgactg tgggagtgct agtcccaacc 421 tttagatggc cattcagttt taagttcaat aagcattttg attgagaaat actttgctga 481 ggagtgaaaa gtccttggct ttgaaagacg aatgatgagc agttcagtgg cccatgtcac 541 agtccaggca cctgccaaag gtgactccct gggaggagca tcttagtcac agagccagtg 601 cctgctgtag gtgtgcagaa gggtgcatgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtatgtgtac 661 gtgtacatgt gtgttggggg aagggagcaa gggttgtggg agcatttctt atctgctctt 721 ctctgcaaga tttcctgtga tttaagtcac attaaagtac ccataagccc gtaatgcaaa 781 agaaccccaa aaccagccca gcagccaacc atggcagcaa gtagatgctc tggtctttag 841 atagtcagaa atgacacttc tgggctctca ggcagtcagt gggttgagct ccccattaaa 901 gtccccctgc caagtctgga atagtcctag tcccgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 961 gtgtgtgtgt acccgcgtgc atatgcgcgc atgcagtgca gggtctgcat acctaaagca 1021 gatgaaattc tgcagaatgg ctgcctcgct agacaaagtc aagaagacag accgaggaga 1081 gagaggttga tgtgtctcca ctaccaagag acaggcttct ctaagccagc gagacatccc 1141 atccaacaat atgaaactgg ccacatttcc ttgagatgtc aacgttgaaa gtgtagctgc 1201 atctttattc ttcactgtta tgaagttggg tgcaacacag cttgagtgga atacaaaaac 1261 accgcttgga aacacatgat ctggatttga atcgcagctg tatcattcac ctgctataga 1321 ctctgagcaa gacctctctg aggttatttc ttcacagtag gtagagacaa gacttacttc 1381 aaaggttctt aaagttgaac ctgagtcaat gaatgcaaaa gtgttcacat ttaaactgta 1441 attttaaagc acaatacaag taaatagcat taatatcatt agagagatta acttagcact 1501 gtgcgtcaca tgattcatca cggccatctg tgagatatca aatagagagg tgaagcctgc 1561 agtaataaaa aatactgcca tagctataaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa |
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