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sun133木蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
多抗制備的詳細(xì)步驟。 已有1人參與
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蟲(chóng)友們，誰(shuí)有制取多抗的標(biāo)準(zhǔn)步驟？我寫了一個(gè)給我的老師，他說(shuō)過(guò)于簡(jiǎn)單，我沒(méi)辦法了！求幫助！ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
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惡魔的左眼
木蟲(chóng) (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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你的步驟是怎么寫的？如果不是論文，只是操作過(guò)程的話，一般來(lái)說(shuō)就那幾個(gè)步驟，如下： 實(shí)驗(yàn)一 免疫血清的制備 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 熟悉免疫血清的制備過(guò)程； 了解動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基本知識(shí)。 二、實(shí)驗(yàn)原理 將抗原物質(zhì)經(jīng)適當(dāng)途徑，按照預(yù)先制定的免疫方案免疫動(dòng)物，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異抗體并釋放入血液，當(dāng)血中抗體達(dá)到一定效價(jià)時(shí)采血，分離血清，即為特異性免疫血清（又稱為抗血清）。因抗原具有多種表位，可激活多個(gè)克隆的B細(xì)胞活化產(chǎn)生抗體，因此，這種免疫血清又稱為多克隆抗體。 本實(shí)驗(yàn)以綿羊紅細(xì)胞（SRBC）作為免疫原，以家兔為免疫動(dòng)物，制備兔抗養(yǎng)紅細(xì)胞免疫血清（也稱為溶血素） 三、器材和材料 1.動(dòng)物 健康成年家兔，雄性，體重2-3kg；健康成年綿羊。 2.試劑 生理鹽水、碘酒、75%酒精。 3.器材 剪刀、鑷子、無(wú)菌注射器、量筒、無(wú)菌毛細(xì)滴管、無(wú)菌試管、離心管、三角燒瓶（200ml）、動(dòng)物固定架、手術(shù)器械一套、塑料放血管等。 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1.抗原制備 （1）用碘酒和75% 消毒綿羊皮膚，抽取頸靜脈血液，注入含有等量阿氏液的三角燒瓶?jī)?nèi)，混勻。阿氏液既有抗凝作用，又適于儲(chǔ)存SRBC。分裝后置4℃冰箱內(nèi)，可使用3周。 （2）無(wú)菌取上述綿羊血于離心管中，用無(wú)菌生理鹽水洗滌紅細(xì)胞，2000r/min，離心5min，吸棄上清液和白細(xì)胞層，再用無(wú)菌生理鹽水與SRBC混勻， 2000r/min，離心5min，重復(fù)3次。最后一次離心10min，以使血細(xì)胞沉積于管底，棄去上清液。 （3）根據(jù)紅細(xì)胞積壓，用生理鹽水配成20%SRBC懸液。 2.免疫動(dòng)物 （1）全班分為4組，每組選擇健康雄性兔1只，用于免疫。 （2）用全血和SRBC懸液按下述方案免疫兔子。 （3）試血 末次注射后第7天，耳靜脈采血1ml ,分離血清，用試管凝集試驗(yàn)滴定效價(jià)。（1：2000以上可用） 3、分離血清 （1） 頸動(dòng)脈放血（心臟采血）并收集于無(wú)菌三角燒瓶中凝固后4℃冰箱過(guò)夜，分離上層血清。然后2500r/min離心10min，收集收集上層血清。 （2）收集的血清經(jīng)鑒定純化后，小量分裝，-20℃凍存。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 收獲的血清應(yīng)無(wú)菌，且無(wú)溶血現(xiàn)象。兔抗SRBC免疫血清的溶血效價(jià)應(yīng)高于1：2000；兔抗人IgG免疫血清的效價(jià)應(yīng)高于1：16。 六、注意事項(xiàng) 抗原制備、免疫動(dòng)物及采集血清等過(guò)程應(yīng)注意菌操作； 免疫的途徑、次數(shù)、間隔時(shí)間因抗原性狀不同而異，應(yīng)合理設(shè)計(jì)免疫方案，并更具具體情況加以調(diào)整； 再次注射免疫原時(shí)，要防治過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生。 頂多再寫一些后續(xù)的抗體蛋白純化的步驟，該不會(huì)你還要寫抗原的制備吧？ |
2樓2015-12-09 10:13:44
惡魔的左眼
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【答案】應(yīng)助回帖
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或者這個(gè)： 一、器材 剪刀（剪兔毛用）一把、彎頭眼科手術(shù)鑷子（游離血管用）一把、直頭眼科手術(shù)剪（剪血管用）一把，手術(shù)刀架，手術(shù)刀片，注射器（1ml、10ml，25ml）附針頭，兔子固定架，滅菌三角燒瓶（200ml）或平皿（直徑450px）、彎頭止血鉗四把，直頭止血鉗兩把，手術(shù)縫合線，塑料放血管，紗布等。 二、試劑 生理鹽水（或PBS） 弗氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant，F(xiàn)CA） 弗氏不完全佐劑（Freund’s incomplete adjuvant，F(xiàn)IA） 二甲苯，酒精棉，脫脂棉，2% NaN3 三、免疫原：蛋白或KLH偶聯(lián)的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。 四、兔子的選擇 兔子的重量應(yīng)在四斤以上，兩耳光滑，明顯可見(jiàn)耳靜、動(dòng)脈，健康。 五、免疫 用生理鹽水稀釋免疫原，然后與相應(yīng)的佐劑進(jìn)行1:1混合�？乖妥魟┩耆旌闲纬煞�(wěn)定的乳劑，將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進(jìn)行皮下注射和后大腿進(jìn)行肌肉注射。每個(gè)區(qū)域大約用1/4的免疫原。這樣免疫原可以持久存在從而提高免疫應(yīng)答。 注： 抗原注射以前需要收集一些正常血清，已備檢測(cè)抗體時(shí)作為陰性對(duì)照。待兔子在新環(huán)境中穩(wěn)定，大概需要四天左右時(shí)間，可以進(jìn)行耳動(dòng)脈取血。取血量約5ml足矣。 免疫用的抗原必須純化，否則影響抗體的質(zhì)量�？乖�(jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射。將抗原液與佐劑等比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩使抗原充分乳化，乳化過(guò)程比較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，但若乳化不充分，會(huì)影響免疫的效果，振蕩后，1000rpm離心一分鐘，如水相和油相不分層即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。 免疫方法可采用背部多點(diǎn)注射法。即于家兔脊柱兩旁選4-6點(diǎn)皮下注射，每點(diǎn)注0.1ml，間隔2周后再于上述部位選不同點(diǎn)注射（不要選擇臨近位點(diǎn)，否則潰瘍愈合不好）。每次免疫的抗原量約100μg。免疫次數(shù)在四五次即可，抗原用量大可以減少次數(shù)。 六、取血： 免疫一周后，可以耳動(dòng)脈取血檢測(cè)抗體效價(jià)。因?yàn)槠鸪鯉状蚊庖弋a(chǎn)生的抗體的效價(jià)比較低，頭兩次取血，夠檢測(cè)用即可。在三次免疫后，可以獲得較高效價(jià)的抗體，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否則會(huì)造成兔子貧血。 前幾次取血用19號(hào)針頭對(duì)兔子進(jìn)行耳動(dòng)脈取血，室溫過(guò)夜析出血清。 最后一次取血可以采用頸動(dòng)脈放血，具體操作如下： 1、家兔仰臥于兔架上固定頭部，用紗布固定四肢。頭部略放低以暴露頸部。剃毛并消毒皮膚。 2、沿頸部中線用手術(shù)刀切開(kāi)皮膚約250px，分離皮下結(jié)締組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突肌（小心操作，如碰到小血管出血，可用止血鉗止血）。 3、用直頭止血鉗分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動(dòng)脈后用彎頭眼科鑷使之游離，剝離神經(jīng)和結(jié)締組織。 4、于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動(dòng)脈用血管夾夾住。 5、用小拇指墊在血管下，用尖頭眼科手術(shù)剪在兩根絲線間的動(dòng)脈璧上剪一小口（勿剪斷），插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫。 6、松開(kāi)止血鉗，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。 七、血清的分離 如果用三角瓶或平皿盛血，將器皿傾斜放置于37oC烘箱2h，轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過(guò)夜，第二天早上用吸管吸取血清。如果用離心管收集，37oC烘箱放置2h，轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過(guò)夜，第二天早上離心，10000RCF，10分鐘。在血清中加入NaN3 至終濃度0.02%，分裝后-20oC保存。 |
3樓2015-12-09 10:18:20
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