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反相液相色譜在多肽及蛋白質(zhì)分離分析中的應(yīng)用
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RPLC 的一個(gè)主要應(yīng)用領(lǐng)域就是多肽和蛋白質(zhì)的制備和分析。對(duì)于分子結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單的多肽和某些蛋白質(zhì) ,在不影響產(chǎn)物的活性或產(chǎn)物在 RPLC 后很容易重新折疊復(fù)性的前提下 ,用 RPLC 進(jìn)行純化制備是一項(xiàng)高效的手段。同時(shí) ,RPLC 分辨率高和重復(fù)性好的特點(diǎn) ,使它在蛋白質(zhì)及多肽分析領(lǐng)域占據(jù)核心地位。盡管在 RPLC 中有機(jī)溶劑的存在及疏水固定相的影響可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的改變 ,但這對(duì)分析鑒定并不重要 ,雖然被分析的蛋白質(zhì)發(fā)生了變性 ,卻能夠給出該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征及疏水性等信息 ,并將其精確地與其它蛋白質(zhì)相區(qū)分。 3. 1 多肽及蛋白質(zhì)純化RPLC 可用于絕大多數(shù)的多肽純化。RPLC 流動(dòng)相以水為基本組成部分 ,與肽的生物學(xué)性質(zhì)相適應(yīng) ,雖然流動(dòng)相中的酸、有機(jī)溶劑以及固定相均可能使肽的天然構(gòu)象發(fā)生變化 ,但當(dāng)這些因素除去后 ,肽的構(gòu)象一般能恢復(fù)原狀 ,因此在 RPLC 中 ,肽的回收率一般在 80 %以上。早在 1986 年 ,人們就用 RPLC 對(duì)神經(jīng)肽進(jìn)行了純化。Boyes 等也報(bào)道了用連續(xù) RPLC 對(duì)細(xì)菌原液中的重組人淀粉狀蛋白前體多肽片 段進(jìn)行分離 。與分子量小、空間折疊相對(duì)簡(jiǎn)單的多肽相比 ,蛋白質(zhì)的 RPLC 分離經(jīng)常存在一些問題。蛋白質(zhì)分子量一般都在萬級(jí)以上 ,很多有亞基結(jié)構(gòu) ,立體構(gòu)型及構(gòu)象復(fù)雜 ,與流動(dòng)相、固定相及樣品中的其它成分以及蛋白質(zhì)本身都可能存在多種復(fù)雜的相互作用 ,會(huì)造成譜帶擴(kuò)散、峰形拖尾等問題 ,甚至發(fā)生變性和不可逆吸附 ,引起回收率和分辨率的降低。因此 ,隨著蛋白質(zhì)體積和疏水性的增加純化難度也會(huì)增加。但是 ,選用適當(dāng)?shù)牟僮鳁l件 ,也可用 RPLC 對(duì)某些蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。核糖體蛋白的純化就是其中一個(gè)具有代表性的例子 。近年來 ,關(guān)于多肽及蛋白質(zhì)的 RPLC 純化也取得了許多成功 ,如 Krusa 等用 RPLC 對(duì)大豆蛋白進(jìn)行了 純化和定量分析 ,其它一些應(yīng)用的實(shí)例見。 3. 2 肽圖闡明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能 ,對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行深入研究都離不開對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)、修飾位點(diǎn)等的了解。在蛋白水解酶(如胰蛋白酶) 或化學(xué)試劑(如溴化氰) 作用下 ,蛋白質(zhì)可被部分裂解 ,RPLC 對(duì)肽段混和物可進(jìn)行有效分離。在這一過程中所獲得的反相色譜圖即稱為該蛋白質(zhì)的“肽圖”。肽圖法已成為 RPLC 在蛋白質(zhì)及多肽分析中最重要、最廣泛的應(yīng)用 ,已用于重組蛋白質(zhì)量控制、疾病診斷等諸多領(lǐng)域。 表 1 RPLC 純度多肽及蛋白舉 反相肽圖中常采用 C18柱,由于酶消化產(chǎn)物含有大量疏水性各不相同的肽段,因此多采用較窄的梯 度并延長(zhǎng)梯度時(shí)間。由于蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中肽段分子量通常較小,借助反相肽圖進(jìn)行蛋白質(zhì)及多肽分析可得到重復(fù)性好、分辨力高的結(jié)果 ,已有多種多肽及蛋白質(zhì)用 RPLC 進(jìn)行了肽圖分析,見表 2 這其中既包括人生長(zhǎng)激素、人粒細(xì)胞集落刺激因子這樣的重要藥物蛋白 ,也包括聚乙二醇 - 人生長(zhǎng)激素這樣的蛋白質(zhì)修飾產(chǎn)物。肽圖分析有利于確定產(chǎn)物的一維結(jié)構(gòu) ,并有可能確定修飾位點(diǎn)。 3. 2. 1 蛋白質(zhì)序列分析 這是肽圖分析的重要應(yīng)用之一。肽圖上各峰經(jīng)氨基酸分析并結(jié)合 Edman 降解或電噴霧質(zhì)譜等手段 ,可得到每一肽段的精確序列。如Moritz 等用 RPLC 對(duì)單克隆抗體A33 進(jìn)行了序 列測(cè)定[3質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展 ,反相肽圖結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜已成為一種方便、快捷的序列測(cè)定方法 ,用于與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫相結(jié)合進(jìn)行分析 ,反相肽圖還可對(duì)未知蛋白進(jìn)行定。 3. 2. 2 分析蛋白質(zhì)的細(xì)微結(jié)構(gòu)差異 天然蛋白質(zhì)的色譜通常無法反映蛋白質(zhì)組成上的細(xì)微不同,而RPLC 以其在揭示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)細(xì)微差異上有出色的表現(xiàn) ,即使一個(gè)氨基酸的改變也可通過相應(yīng)肽段保留時(shí)間的變化清楚反映出來。例如 ,肽段上脫酰胺作用常常引起保留時(shí)間的輕微延長(zhǎng) ,而氧化產(chǎn)物如甲硫氨酸亞砜或半胱磺酸的形成常引起保留時(shí)間的顯著下降。同樣 ,變異蛋白質(zhì)的形成也會(huì)引起一個(gè)或多個(gè)肽段保留時(shí)間的變化。 3. 2. 3 蛋白質(zhì)修飾分析 隨著人們對(duì)蛋白質(zhì)修飾的研究不斷深入 ,RPLC 不僅被用來分離修飾與未修 飾產(chǎn)物 ,在修飾產(chǎn)物分析上也得到了很好應(yīng)用。蛋白質(zhì)修飾包括蛋白質(zhì)在體內(nèi)的翻譯后修飾如形成 N2甲酸基或 N2乙�；苌镞M(jìn)行 N 端封閉;形成氨基化物進(jìn)行 C 端封閉; Ser 、Thr 、Tyr 等含羥基的氨基酸 磷酸化 , Asn 的 N2糖基化及 Ser 、Thr 的 O2糖基化。還包括人工化學(xué)修飾如聚乙二醇、葡聚糖修飾等。借助 RPLC 可闡明修飾的位點(diǎn)及其化學(xué)本質(zhì)。由于糖肽在 RPLC 中的保留行為與其糖基化水平密切相關(guān) ,糖基化程度越高 ,保留時(shí)間越短,因此可將糖蛋白水解成肽段后進(jìn)行反相色譜分析 ,從而得到糖基化水平及所處肽段。Huddleston 等專門討 論了糖基化的定性分析。同樣 ,磷酸化蛋白質(zhì)中連接磷酸基的數(shù)量、位置等也可從 RPLC 分析中得出。無論是翻譯后修飾還是化學(xué)修飾 ,修飾位點(diǎn)的測(cè)定多采用對(duì)蛋白質(zhì)作肽圖后經(jīng)比較確定被修飾的 肽段 ,再結(jié)合質(zhì)譜分析得到精確位點(diǎn) ,這方面已做了許多有意義的工作。Ogueta 等就利用 RPLC 和離子阱質(zhì)譜對(duì)兩種蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行了分析 ,得到了很好的結(jié)果。這一方法也可用于化學(xué)交聯(lián)蛋白 質(zhì)分析 ,如交聯(lián) RNase A 中的交聯(lián)位點(diǎn)。該分析方法還可用于蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)及結(jié)合位點(diǎn)等的鑒 定。但在有些蛋白質(zhì)的大分子修飾位點(diǎn)判斷中 ,修飾上的分子對(duì)酶解及肽段分離的影響會(huì)對(duì)分析造 成困難。 3. 3 酶活測(cè)定隨著 RPLC 在臨床及生物醫(yī)藥中廣泛地應(yīng)用 ,人們開始利用它來檢測(cè)體內(nèi)特定酶的活性。酶活性測(cè)定多采取分光光度法 ,但這種方法需要所測(cè)樣品達(dá)到一定純度。RPLC 可經(jīng)特異監(jiān)控底物及產(chǎn)物濃度直接測(cè)量體液和組織中的酶活性 ,具有特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)。通常將樣品加入合適底物 ,通過加熱、加酸或加入特定抑制劑終止反應(yīng) ,用反相液相色譜測(cè)定底物或產(chǎn)物濃度的改變并計(jì)算出酶活性 ,也可直接從活體的體液中底物或產(chǎn)物濃度變化來監(jiān)測(cè)酶活性。另外 ,由于 RPLC 可精確測(cè)定肽段的磷酸 化 ,也有人將其用于酪氨酸激酶的活性測(cè)定。Hartwick 等 曾通過 RPLC 監(jiān)測(cè)腺苷的濃度來確定紅血球中腺苷脫氨酶的活性 ,還借助 RPLC 成功地測(cè)定了 3′AMP 合成酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶、黃嘌呤氧化酶等的活性 ,表現(xiàn)出 RPLC 在這一 領(lǐng)域的巨大潛力。 3. 4 檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象改變RPLC 應(yīng)用中的另一個(gè)重要方面是對(duì)多肽和蛋白質(zhì)的不同構(gòu)象中間體及其之間相互轉(zhuǎn)變的研究 ,這方面已有大量工作 , 如對(duì)胰島素 、溶菌酶 、重組生長(zhǎng)因子和 N 甲基重組生長(zhǎng)因子 及細(xì)胞z素C等多種蛋白質(zhì)及多肽在 RPLC 的疏水環(huán)境中構(gòu)象變化的研究。這些研究的共同特征是蛋白質(zhì)和多肽的吸附和解吸附與溶劑或配基引起的構(gòu)象改變有關(guān)。蛋白在 RPLC 固定相上的保留行為是基于蛋白質(zhì)與固定相配基間的非特異性疏水相互作用 ,這種疏水作用力的強(qiáng)弱與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)尤其與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)的暴露程度有著密切的關(guān)系。它不僅取決于蛋白質(zhì)的氨基酸序列 ,更取決于蛋白質(zhì)與固定相發(fā)生作用時(shí)特定的空間構(gòu)象。不同條件下 ,由于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)發(fā)生不同程度的暴露 ,與固定相配基作用的位點(diǎn)也隨之變化 ,從而在 RPLC 中反 映出色譜行為的改變。因此 ,可以利用 RPLC 來分析蛋白質(zhì)分子表面疏水性和空間構(gòu)象的穩(wěn)定性重組蛋白的測(cè)序。如果酶解過程中控制條件使二硫鍵不被破壞 ,通過比較二硫鍵還原前后的肽圖即可 判斷二硫鍵的位置。Cunsolo 即用上述方法對(duì)一種花粉蛋白中某肽段二硫鍵的位置進(jìn)行了表征 。如如果蛋白質(zhì)或多肽的空間構(gòu)象比較穩(wěn)定 ,那么在各種不同的色譜條件下 ,蛋白質(zhì)與配基的結(jié)合位點(diǎn)不容易改變 ,保留機(jī)制不變。反之 ,因空間構(gòu)象的變化 ,就有可能采用不同的保留機(jī)制。這為測(cè)定構(gòu)象中間體轉(zhuǎn)變過程的動(dòng)力學(xué)及熱動(dòng)力學(xué)提供了直接手段。RPLC 在蛋白質(zhì)構(gòu)象改變研究中的應(yīng)用已表現(xiàn)出巨大潛力。Kumar 等使用 RPLC 證明了 RNase A 經(jīng)三氯乙酸處理后構(gòu)象的改變 。還有人通過用 RPLC 分離變化過程中的各種折疊中間體 ,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了牛胰島素在二硫蘇糖醇作用下去折疊的過程 。另外 ,Mccrossin 等還通過 RPLC 分離和肽圖分析相結(jié)合檢測(cè)了鹽酸胍存在下豬生長(zhǎng)激素的降解情況。隨著反相材料和檢測(cè)手段的發(fā)展 ,RPLC 在蛋白質(zhì)構(gòu)象行為研究中的潛力已被越來越多的人們所認(rèn)識(shí)。 原文地址：ontores-新浪博客 |
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