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專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能

[交流] 定點(diǎn)突變的常見(jiàn)問(wèn)題及策略-BioEngX發(fā)布

定點(diǎn)突變（site-directed mutagenesis）并不是一個(gè)復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)，然而有時(shí)候我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中卻會(huì)遇到各種各樣的問(wèn)題。一些常見(jiàn)的問(wèn)題包括但不限于: 菌落太多；沒(méi)有菌落生長(zhǎng)；得到菌落，但菌落中不含有目的突變點(diǎn)等。

如何分析出現(xiàn)問(wèn)題的原因并解決這些問(wèn)題呢？
小編能提供的最好的建議就是在進(jìn)行定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要有對(duì)照組（control）。許多定點(diǎn)突變?cè)噭┖兄卸紩?huì)包含對(duì)照用的模板，引物以及轉(zhuǎn)化時(shí)候的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。對(duì)照實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驇椭愀菀椎卮_定可能出現(xiàn)問(wèn)題的實(shí)驗(yàn)操作步驟，節(jié)省你的時(shí)間以及試劑耗材。
下面是一些在定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)過(guò)程中解決常遇問(wèn)題的小技巧：
當(dāng)平板上菌落(colonies)太多時(shí):
1、降低PCR反應(yīng)中的模板（template）濃度
2、減少轉(zhuǎn)化時(shí)PCR產(chǎn)物的用量
將不同體積的轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物涂在平板上，比如10 ?l, 20 ?l, 50 ?l, 100 ?l。選取菌落分布最合適（well-spaced）的平板挑選陽(yáng)性克隆。
3、延長(zhǎng)Dpn I酶切（digestion）時(shí)間，比如酶切2個(gè)小時(shí)，代替1個(gè)小時(shí)

當(dāng)平板上沒(méi)有菌落時(shí):
1、提高PCR反應(yīng)中模板的用量
2、提高轉(zhuǎn)化時(shí)PCR 產(chǎn)物的用量
3、如果DNA電泳中顯示PCR 產(chǎn)物濃度不高或PCR失敗，可以試用不同的溫度梯度進(jìn)行PCR 反應(yīng)
4、改變PCR反應(yīng)的延伸時(shí)間及溫度（比如降低溫度到68 oC, 以60 s /Kb的比例設(shè)置延伸時(shí)間）
5、PCR反應(yīng)時(shí)加入一點(diǎn) DMSO (2-8%)，用來(lái)輔助富含GC的區(qū)域雙鏈的分離
6、檢查感受態(tài)（competent cells）細(xì)胞是否有效（利用對(duì)照質(zhì)粒）
7、濃縮酶切后的DNA，可以利用乙醇（Ethanol）沉淀（precipitate）酶切過(guò)的DNA, 然后在轉(zhuǎn)化前用更小體積的液體重懸（re-suspend）之
8、轉(zhuǎn)化前純化DNA樣品，取出PCR反應(yīng)中的鹽離子
菌落中沒(méi)有目的突變型(desired mutation):
1、利用含有Dam甲基化酶（methylase）的菌株擴(kuò)增模板質(zhì)粒，比如JM109，DH5ɑ。可能有些同學(xué)不明白這為何意，待小編一一道來(lái)。Dam甲基化酶可將GATC序列中的腺嘌呤N6位點(diǎn)進(jìn)行甲基化修飾，而這一位點(diǎn)恰恰是DpnI 酶的識(shí)別位點(diǎn)。因此不能應(yīng)用Dam甲基化酶缺失的菌株生產(chǎn)模板質(zhì)粒，比如JM110 菌株。這種菌株產(chǎn)生的DNA無(wú)法被DpnI酶切掉，轉(zhuǎn)化DNA中含有野生型模板，將產(chǎn)生大量的假陽(yáng)性（fake positives）。
提高DpnI 酶切時(shí)間或者提高DpnI酶的用量
2、減少PCR循環(huán)數(shù)，過(guò)多的PCR循環(huán)可能導(dǎo)致非特異性突變點(diǎn)的引入
3、如果上述策略仍不能解決問(wèn)題，那只能重新設(shè)計(jì)引物了，有關(guān)引物設(shè)計(jì)問(wèn)題，詳見(jiàn)歷史信息

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