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多肽標(biāo)記及修飾
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目前多肽標(biāo)記及修飾的內(nèi)容非常多，廣泛應(yīng)用在抗原肽多肽藥物，多肽生物學(xué)，多肽抗體以及多肽試劑的研究中。目前應(yīng)用比較廣泛的有：非放射性核素標(biāo)記（C13，H2），熒光標(biāo)記（FAM，F(xiàn)ITC），生物素標(biāo)記，磷酸化修飾等。 一、非放射性核素標(biāo)記 目前在非放射性核素標(biāo)記中，使用廣泛的仍然是C13，H2，因?yàn)槠涫褂冒踩派湫孕 ，F(xiàn)在有比較完全的非放射性標(biāo)記的氨基酸，可以按照正常的多肽合成方法將標(biāo)記好的氨基酸直接連接到抗原肽多肽上。 二、熒光標(biāo)記 熒光標(biāo)記由于沒有放射性，實(shí)驗(yàn)操作簡單。因此，目前在生物學(xué)研究中熒光標(biāo)記應(yīng)用非常廣泛，熒光標(biāo)記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，對(duì)于有游離羧基的采用的方法與接肽反應(yīng)相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。但是對(duì)于FITC標(biāo)記，需要在連接FITC前，增加一個(gè)氨基己酸，避免在切割的過程中被TFA切割掉。 三、生物素標(biāo)記 生物素-親合素系統(tǒng) (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級(jí)放大效應(yīng)，并與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進(jìn)一步提高。主要有用于標(biāo)記多肽氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)和生物素對(duì)硝基酚酯(pBNP)，其中以BNHS最常用，當(dāng)然，也可以直接使用生物素也可以標(biāo)記，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)上有個(gè)游離的羧基，采用HBTU/HOBt/DIEA方法縮合，由于生物素的溶解度低，使用DMSO/DMF的混合溶劑增加溶解度。 四、磷酸肽合成 磷酸肽在生命過程中發(fā)揮重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Ser，Thr，Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是單芐基磷酸化氨基酸，Tyr也可以直接使用磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的連接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用該方法合成磷酸化也有缺點(diǎn)，特別是在合成多磷酸化多肽或長肽的時(shí)候，連接效率低，最后產(chǎn)品純度很低，對(duì)于這種磷酸化多肽，我們考慮采用后磷酸化方法，其合成過程就是在多肽合成結(jié)束后，選擇性脫去要標(biāo)記的氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基，對(duì)于Tyr，Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護(hù)的氨基酸進(jìn)行反應(yīng)，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1% TFA/DCM條件下可以定量的脫除。后磷酸化，采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連接到羥基上，隨后在過氧酸下氧化生成磷�；�，完成反應(yīng)。 原文地址：http://blog.sina.com.cn/s/blog_132fb62500102w2tf.html 2.jpg |
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