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細(xì)胞周期流式檢測步驟詳解
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材料與試劑： 全稱 簡稱 貨號 PBS —— 乙醇，70-80%,提前放置-20°C預(yù)冷 固定劑 —— BD Pharmingen™ stain buffer, or equivalent, 1X PBS, 2% FBS, 0.1% NaN3 (pH 7.1–7.4) 染色液 554656 BD Pharmingen™ PI/RNase staining buffer (for PI/Rnase staining) PI/RNase染色液 550825 BD Pharmingen™ 7-AAD (7-Amino-Actinomycin D) staining solution (for 7-AAD staining) 7-AAD染色液 559925 使用說明： DNA染料，尤其是PI，具有較強的粘性。樣本上機檢測之后，應(yīng)遵照儀器說明書仔細(xì)清洗流式細(xì)胞儀，以免對下一位操作者結(jié)果造成影響 。 固定好的細(xì)胞可保存長達12個月 (儲存于70-80% 的乙醇，置于 -20°C保存). 操作步驟： 1. 收獲細(xì)胞于流式管中，加入3-4ml的PBS清洗細(xì)胞。 2. 1000rpm離心10分鐘，棄上清。 3. 逐滴加入5ml或更多預(yù)冷的70-80%的乙醇，渦旋混勻細(xì)胞， 4°C避光過夜（>18小時）。 4. 1000-1500rpm 離心細(xì)胞10分鐘，棄上清。之后清洗細(xì)胞2次以去除所有的乙醇。 注：第一次用1x PBS，第二次用染色液（貨號：554656）。 5. 細(xì)胞染色：每管樣本需10^6細(xì)胞。具體操作如下： 1) 對于PI/RNase 染色，將細(xì)胞重懸于0.5 mL PI/RNase 染色液（貨號：550825）。 2) 對于7-AAD染色，將細(xì)胞重懸于0.1 mL 染色液（貨號：554656），同時加入20 μL7-AAD染色液（貨號：559925） 6. 室溫避光孵育15分鐘。 7. 分析前4℃避光保存樣本。1小時之內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。 樣本制備注意事項： • 獲得單個細(xì)胞，盡量避免DNA的降解 • 樣本最關(guān)鍵的就是減少碎片（EDTA/不可過度吹打/離心rpm） • PI既能與DNA結(jié)合，又能與RNA結(jié)合，所以要用RNase降解 • PI質(zhì)量及RNase所加量很重要，建議用商品化試劑 • 污染脫氧核糖核酸酶會降解DNA，故玻璃器皿和試劑要干凈滅菌 樣本檢測注意事項： • 進樣速度：一般檢測細(xì)胞濃度調(diào)整為2E5–2E6/ml，進樣速度為低速。若峰形較寬，可能就是進樣速度太快 • 儀器質(zhì)控定期做，盡可能排除因機器設(shè)置引起的峰形加寬 • 排除粘連細(xì)胞（FL2-A/FL2-W） • 通過電壓脈沖信號的寬度和面積區(qū)別實體組織標(biāo)本中的粘連細(xì)胞群體，最大程度的減少粘連細(xì)胞帶來的假陽性結(jié)果 優(yōu)寧維流式網(wǎng)（http://www.my-fcm.com.cn） 免費流式抗體查詢 | 免費熒光配色 | 免費流式課堂 QQ圖片20151223090631.png |
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