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yingmeiqi新蟲 (小有名氣)
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[求助]
求教土壤蛋白酶測定過程中的一些問題？
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用的是“蔡紅，沈仁方”的改良茚三酮法，有所改動，稱取的土壤由5g改變?yōu)?.2g，酪酸鈉沒有用干酪素配制，而是直接用，方法如下： 2 .3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取50 、100 、150 、200 、250 、300 μl 0 .01 %甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液, 置于10 ml 刻度試管中(濃度分別相 當(dāng)于NH2 0 .107 、0 .213 、0 .320 、0 .426 、0 .533 、0 .639 μgml-1), 加入2 ml pH5 .8 的乙酸—乙酸鈉緩沖溶液,再加入1 .5 ml 茚三酮—乙醇—抗壞血酸混合試劑, 混合均勻, 沸水浴加熱16 min , 取出立即用自來水冷卻15 min , 加入1 ml 0 .2 %KIO3 并混合均勻, 用蒸餾水定容至10 ml , 1 h 內(nèi)在570 nm 處比色測定吸光值(本次試驗使用了TU-1800 紫外可見分光光度計, 北京普儀)。以氨基氮(NH2)的濃度為橫坐標(biāo), 吸光值 為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2 .4 培養(yǎng)與測定 稱取0.2g 土壤, 加入2 ml Tris —HCl —CaCl2 混合溶液和1 ml 甲苯, 混合均勻后靜置15 min 以抑制微生物活性, 然后再加入5 ml 2 %的酪酸鈉溶液, 50 ℃振蕩培養(yǎng)2 h 。對照土壤在培養(yǎng)過程中不加酪酸鈉溶液, 但在培養(yǎng)結(jié)束后加入, 且加入的酪酸鈉也經(jīng)歷50 ℃、2 h 的振蕩培養(yǎng)過程。培養(yǎng)結(jié)束并在對照中加入酪酸鈉后, 充分混合,置于0 ～ 4 ℃冷藏柜中靜置30 min 。取出加入1 .5 ml 0 .6 mol L-1乙酸鉛溶液, 6000 g 離心10 min , 取上清液1.5ml , 加入457 μl 草酸鈉—乙酸混合溶液,17 000 g 再離心10 min , 小心吸取1 ml 上清液, 按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的辦法測定吸光值。 每個土樣設(shè)置3 個重復(fù)。 問題如下： 1）方法中使用的酪酸鈉，要求用干酪素進(jìn)行配制風(fēng)干后得到，我們的實驗中，直接用酪酸鈉稱取2g進(jìn)行，是否有影響？ 2）方法中有一個乙酸鉛的藥品，直接用水加熱溶解，會形成水解物，為渾濁，于是加入了些許乙酸，進(jìn)行溶解，再加水，為清澈液體，加入的乙酸會不會對結(jié)果有影響？ 3）處理完的試劑為茶色或土黃色，并不是藍(lán)紫色，測到的結(jié)果為正值，但如果減去空白，得到的則為負(fù)值，這是合理的么？ |
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酪酸鈉的制備:將市售干酪素溶于1 %Na2CO3 溶液,并用醋酸使溶液酸化至pH4 .0 , 使蛋白質(zhì)沉淀下來。用冷水將沉淀小心洗滌至中性, 再用1∶1 的乙醇—乙醚混合物處理, 在通風(fēng)櫥里風(fēng)干 。冷凍保存。 2 %酪酸鈉溶液:稱取2g 酪酸鈉, 加入10ml 0 .1mol L-1的NaOH 溶液, 沸水浴處理5 min , 待膨化后加入pH7 .6 的tris —HCl 緩沖液約80 ml , 繼續(xù)沸水浴處理, 直至完全溶解, 用同樣的緩沖液定容至100ml 。 按照以上方法，溶解的干酪素，制備成酪酸鈉，再配成酪酸鈉溶液的。完全參考蔡紅、沈仁方2005年的方法，已經(jīng)制備成功 |
3樓2016-01-21 11:47:03
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2樓2016-01-13 21:51:47
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4樓2016-01-21 11:49:53
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