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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » DNA重組 » 體外轉錄檢測敏感性問題
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95846713新蟲 (初入文壇)
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[求助]
體外轉錄檢測敏感性問題
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| 本人投了一篇文章，由于做的病毒體外極難培養(yǎng)，且是RNA病毒，故從病料中提取RNA后，經PCR擴增后克隆于pMD18-T上，稀釋重組質粒換算拷貝數(shù)以檢測病毒敏感性，而報社編輯說：實驗中存在技術性缺陷，即檢測 RNA 病毒卻采用重組質粒（ DNA ）作為模板進行標準曲線建立和敏感性試驗，由于 RNA 在反轉錄制備 cDNA 過程中的效率并不是 100% ，對于不能夠體外培養(yǎng)的 RNA 病毒，則可以通過檢測的靶基因克隆于含有體外轉錄的 T7 或 T3 啟動子質粒中（如 pGEM-T 系列質粒），提取含有目的基因的重組質粒，檢測其相關的 OD 值，通過公式計算其重組質粒的拷貝數(shù)后，采用體外轉錄試劑盒進行 RNA 的轉錄。將體外制備的 RNA 轉錄為模板進行反轉錄，制備 cDNA ，并將其進行倍比系列稀釋，分別以不同稀釋度的 cDNA 作為模板進行熒光定量 PCR 擴增確定其檢測的敏感性。 我的問題是：1.直接拿體外轉錄獲得的RNA進行稀釋來做敏感性試驗不行嗎？為什么要用它再次反轉錄cDNA來檢測敏感性？ 這么做嚴謹嗎？ 2.體外轉錄獲得的RNA再反轉錄成cDNA這樣折騰一遍不是跟編輯說的RNA 在反轉錄 cDNA 過程中的效率并不是 100%又一樣了嗎？ |
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