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陳園園123銀蟲(chóng) (初入文壇)
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版納微型豬近交系（BMI）是世界上第一個(gè)培育成功的大型哺乳動(dòng)物近交系，在開(kāi)展異種器官移植、疾病動(dòng)物模型、基因修飾、轉(zhuǎn)基因、基因敲除研究等方面具有巨大的應(yīng)用前景。本課題針對(duì)BMI豬→人異種器官移植過(guò)程中與免疫排斥反應(yīng)相關(guān)的基因進(jìn)行基礎(chǔ)研究，利用數(shù)字基因表達(dá)譜、生物信息學(xué)、比較基因組學(xué)、定位候選克隆策略、差異表達(dá)和協(xié)同表達(dá)EST等方法篩選并初步確定與免疫排斥反應(yīng)相關(guān)的基因。采用qPCR法檢測(cè)基因的表達(dá)水平，通過(guò)表達(dá)水平與免疫排斥反應(yīng)的相關(guān)性分析，確定與排斥相關(guān)的關(guān)鍵候選基因。 研究中篩選并已克隆了相關(guān)基因73個(gè)，通過(guò)qPCR方法檢測(cè)了這些基因在30-40個(gè)組織中的mRNA表達(dá)水平，證明了不同基因在相同的組織中表達(dá)量不同，同一基因在不同的組織中表達(dá)量也具有明顯差異，呈現(xiàn)強(qiáng)、中、弱、無(wú)等不同表達(dá)豐度，揭示不同基因在不同組織中行使的功能不同。進(jìn)一步對(duì)基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了功能生物信息學(xué)分析，確定了蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、保守結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)、疏水性、蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)、亮氨酸富集的核輸出信號(hào)、功能位點(diǎn)等12項(xiàng)重要指標(biāo)，并對(duì)氨基酸序列進(jìn)行了多物種比對(duì)分析和聚類(lèi)分析，揭示了基因在不同物種中的保守程度以及和人的相似程度。73個(gè)基因均已獲得GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)認(rèn)證的登錄號(hào)，這些基因序列的注釋以及對(duì)其功能的初步研究可為深入研究這些基因的表達(dá)調(diào)控、功能鑒定等奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。 通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)大量比對(duì)結(jié)合功能生物信息學(xué)分析，最終確定了主要與豬→人異種移植免疫排斥相關(guān)的基因9個(gè)（ASGR1、B4GALNT2、CD80、CMAH、CPN10、ICAM-2、OXSR1、P65、ULBP1），進(jìn)一步構(gòu)建了目的基因和綠色熒光蛋白報(bào)告基因的融合真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染PK15豬腎上皮細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)，并從蛋白水平進(jìn)行了Western Blot驗(yàn)證。本研究建立了利用近緣物種基因序列以及拼接豬EST序列克隆BMI基因、利用qPCR技術(shù)檢測(cè)BMI基因多組織mRNA表達(dá)水平及利用真核核表達(dá)系統(tǒng)和Western Blot印跡研究BMI基因功能的技術(shù)方法。本研究結(jié)果為異種移植中免疫排斥反應(yīng)相關(guān)基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，也為下一步進(jìn)行基因修飾和基因敲除確定重要目標(biāo)靶基因，最終為提高版納微型豬近交系在異種器官移植領(lǐng)域中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 |
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