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陳園園123銀蟲 (初入文壇)
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版納微型豬近交系（BMI）是世界上第一個培育成功的大型哺乳動物近交系，在開展異種器官移植、疾病動物模型、基因修飾、轉(zhuǎn)基因、基因敲除研究等方面具有巨大的應(yīng)用前景。本課題針對BMI豬→人異種器官移植過程中與免疫排斥反應(yīng)相關(guān)的基因進(jìn)行基礎(chǔ)研究，利用數(shù)字基因表達(dá)譜、生物信息學(xué)、比較基因組學(xué)、定位候選克隆策略、差異表達(dá)和協(xié)同表達(dá)EST等方法篩選并初步確定與免疫排斥反應(yīng)相關(guān)的基因。采用qPCR法檢測基因的表達(dá)水平，通過表達(dá)水平與免疫排斥反應(yīng)的相關(guān)性分析，確定與排斥相關(guān)的關(guān)鍵候選基因。 研究中篩選并已克隆了相關(guān)基因73個，通過qPCR方法檢測了這些基因在30-40個組織中的mRNA表達(dá)水平，證明了不同基因在相同的組織中表達(dá)量不同，同一基因在不同的組織中表達(dá)量也具有明顯差異，呈現(xiàn)強(qiáng)、中、弱、無等不同表達(dá)豐度，揭示不同基因在不同組織中行使的功能不同。進(jìn)一步對基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了功能生物信息學(xué)分析，確定了蛋白質(zhì)的分子量、等電點、保守結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、信號肽、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)、疏水性、蛋白質(zhì)磷酸化位點、亮氨酸富集的核輸出信號、功能位點等12項重要指標(biāo)，并對氨基酸序列進(jìn)行了多物種比對分析和聚類分析，揭示了基因在不同物種中的保守程度以及和人的相似程度。73個基因均已獲得GenBank數(shù)據(jù)庫認(rèn)證的登錄號，這些基因序列的注釋以及對其功能的初步研究可為深入研究這些基因的表達(dá)調(diào)控、功能鑒定等奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。 通過GenBank數(shù)據(jù)庫大量比對結(jié)合功能生物信息學(xué)分析，最終確定了主要與豬→人異種移植免疫排斥相關(guān)的基因9個（ASGR1、B4GALNT2、CD80、CMAH、CPN10、ICAM-2、OXSR1、P65、ULBP1），進(jìn)一步構(gòu)建了目的基因和綠色熒光蛋白報告基因的融合真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染PK15豬腎上皮細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)檢測，并從蛋白水平進(jìn)行了Western Blot驗證。本研究建立了利用近緣物種基因序列以及拼接豬EST序列克隆BMI基因、利用qPCR技術(shù)檢測BMI基因多組織mRNA表達(dá)水平及利用真核核表達(dá)系統(tǒng)和Western Blot印跡研究BMI基因功能的技術(shù)方法。本研究結(jié)果為異種移植中免疫排斥反應(yīng)相關(guān)基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，也為下一步進(jìn)行基因修飾和基因敲除確定重要目標(biāo)靶基因，最終為提高版納微型豬近交系在異種器官移植領(lǐng)域中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 |
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