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[求助]
巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞提取蛋白濃度低，該怎么辦
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最近在從巨噬細(xì)胞中提取蛋白，提出蛋白后用BCA測(cè)定蛋白濃度，但是只有0.8mg/ml左右，不知道該怎么辦，求各位大神指點(diǎn)一下。 具體操作步驟如下： 先是鋪板后給藥，提蛋白前細(xì)胞已經(jīng)特別密集的分布到六孔板中有些甚至疊起來(lái)。 1.細(xì)胞用培養(yǎng)基吹打下來(lái)，收集細(xì)胞懸液1000rpm離心5分鐘（因?yàn)橐峥偟鞍装さ鞍讻](méi)就沒(méi)用胰酶消化）。 2.用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次洗滌后盡可能吸干上清。 3.每孔加入150μl RIPA裂解液（臨用前加入PMSF，終濃度為1mM）混勻，轉(zhuǎn)入96孔板中4℃震蕩30分鐘。 4.14000rpm離心10分鐘。將上清快速吸入預(yù)冷的干凈EP管中（注意不要吸到沉淀）。 5.BCA測(cè)定蛋白濃度。 我這樣提取出來(lái)的濃度最大也就0.8mg/ml,后來(lái)每孔加100ul的 RIPA裂解液甚至兩個(gè)孔加100ul的RIPA裂解液濃度也一直上不來(lái)。不知道是什么原因，都快要愁死了。。。RIPA裂解液我是用的碧云天的 P0013B，強(qiáng)的裂解液，含有20mM Tris (pH7.5)， 150mM NaCl， 1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate， β- glycerophosphate， EDTA， Na3VO4， leupeptin等多種抑制劑。說(shuō)是有蛋白酶抑制劑，磷酸酯酶抑制劑。 求各位大神指點(diǎn)一下。。。。。 |
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zd1984hero
鐵桿木蟲(chóng) (正式寫手)
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- 專業(yè): 細(xì)胞衰老
【答案】應(yīng)助回帖
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我覺(jué)得主要是細(xì)胞裂解不充分，還有就是你加裂解液太多了30-50ｕl 即可！另外你收集細(xì)胞的時(shí)候離心速度大點(diǎn)10000rpm左右吧。裂解細(xì)胞時(shí)，用裂解液把tube中的細(xì)胞吹散（反復(fù)三十次），放至室溫三十分鐘，然后放到四度400-500rpm震蕩，接下來(lái)的基本沒(méi)什么問(wèn)題！ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
2樓2016-01-08 21:32:19
3樓2016-01-08 21:43:30
zd1984hero
鐵桿木蟲(chóng) (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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779233023: 金幣+10, 博學(xué)EPI+1, ★★★很有幫助 2016-01-13 22:16:27
779233023: 金幣+10, 博學(xué)EPI+1, ★★★很有幫助 2016-01-13 22:16:27
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1. 不會(huì)破壞細(xì)胞，我用13000rpm 2. 不用轉(zhuǎn)到96空板振，就放在tube中振，你的細(xì)胞就是裂解不好才濃度低的 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
4樓2016-01-09 13:46:57
5樓2016-01-13 22:16:59
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