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專業(yè): 腫瘤研究體系新技術(shù)

[交流] 活體動(dòng)物體內(nèi)成像技術(shù)的重要綜述

活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)（GFP、RFP, Cyt及dyes等）進(jìn)行標(biāo)記。利用靈敏的光學(xué)檢測(cè)儀器，可以直接檢測(cè)活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。通過(guò)這些技術(shù)，可以觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、疾病的發(fā)生發(fā)展、基因的表達(dá)及反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。相對(duì)于其它活體動(dòng)物體內(nèi)成像技術(shù)，如超聲（Ultrasound）、計(jì)算機(jī)斷層攝影（Computed Tomography ，CT）、核磁共振（Magnetic Resonance Imaging ，MRI）、正電子衍射成像（Positron-Emission Tomography，PET）、單光子衍射(Single-Photon-Emission Computed Tomography, SPECT)等技術(shù)，光學(xué)成像具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀、測(cè)量快速、靈敏度高及費(fèi)用低廉等。在剛剛發(fā)展起來(lái)的幾年內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像主要的功能是追蹤并檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞在體內(nèi)的活動(dòng)及標(biāo)記基因在體內(nèi)的表達(dá)。這類技術(shù)已用于許多領(lǐng)域，具有廣泛的適用性。主要來(lái)說(shuō)有以下幾個(gè)方面：以熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞，標(biāo)記病毒及DNA, 標(biāo)記基因表達(dá)，標(biāo)記生物大分子及其相互作用，和利用熒光素酶標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型進(jìn)行一系列分子生物學(xué)和藥物在活體動(dòng)物體內(nèi)的研究。下面我們?cè)敿?xì)介紹幾個(gè)主要方面。
以熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞，可以觀察標(biāo)記的細(xì)胞在體內(nèi)的活動(dòng)和反應(yīng)。很多常用的腫瘤細(xì)胞已被熒光素酶標(biāo)記。利用皮下，靜脈或原位接種后，可實(shí)時(shí)觀察這些細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移，以及對(duì)藥物的反應(yīng)。因?yàn)檫@個(gè)技術(shù)的靈敏度能觀察到100個(gè)左右的細(xì)胞，可以在其與周圍正常組織無(wú)明顯形態(tài)學(xué)變化時(shí)，就可通過(guò)光學(xué)成像進(jìn)行識(shí)別，靈敏地觀察到微小的轉(zhuǎn)移灶。應(yīng)用其準(zhǔn)確的定量性能和功能成像特性，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度判斷腫瘤的進(jìn)程，可以直接快速測(cè)量腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。許多歐美的藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)，制藥公司和生物技術(shù)公司都利用這個(gè)技術(shù)的研究結(jié)果作為其FDA藥物報(bào)批中很重要的一部分。
用同樣方法標(biāo)記免疫細(xì)胞和干細(xì)胞，可以觀察這些細(xì)胞在體內(nèi)的活動(dòng)�，F(xiàn)行的骨髓移植技術(shù)通常檢測(cè)供體造血干細(xì)胞在受體骨髓中的數(shù)目，是一種終點(diǎn)檢測(cè)方法。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因鼠，將熒光素酶標(biāo)記的造血干細(xì)胞移植入脾及骨髓，可以通過(guò)生物發(fā)光實(shí)時(shí)檢測(cè)這些干細(xì)胞的后代在動(dòng)物體內(nèi)的生長(zhǎng)和活動(dòng)。免疫細(xì)胞可以用一般的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方式標(biāo)記，干細(xì)胞標(biāo)記需要通過(guò)Lentivirus或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)實(shí)現(xiàn)。這方面的技術(shù)已用于研究干細(xì)胞移植，腫瘤免疫，毒血癥，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，皮炎[28]等發(fā)病機(jī)制，也用來(lái)評(píng)價(jià)T細(xì)胞的免疫特異性，增殖、遷移及功能等。
熒光素酶也可以用來(lái)標(biāo)記病毒及其他DNA分子，例如siRNA等。大量的文章也將活體動(dòng)物成像技術(shù)應(yīng)用于基因治療的研究中。因?yàn)榛蛑委熤饕且圆《咀鲚d體，將熒光素酶基因作為報(bào)告基因加入載體，可觀察目的基因是否到達(dá)動(dòng)物體內(nèi)的特異組織和是否持續(xù)高效表達(dá)。發(fā)表的文章有腺病毒，腺相關(guān)病毒AAV2及AAV5，Sindbis, CMV, HPV等等。這種非侵入方式可以直接，實(shí)時(shí)地觀察到這些病毒或載體在動(dòng)物體內(nèi)的侵染和活動(dòng)，了解到用其他方法無(wú)法看到的一些病毒侵染部位和時(shí)域信息。熒光素酶基因也可以插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中，用來(lái)觀察脂質(zhì)體為載體的DNA運(yùn)輸和基因治療情況。將靶基因以熒光素酶標(biāo)記，McCaffrey 等成功應(yīng)用siRNA及shRNA減弱了小鼠轉(zhuǎn)染的熒光素酶的表達(dá)，第一次在活體動(dòng)物體內(nèi)實(shí)時(shí)觀察到siRNA對(duì)特異靶基因表達(dá)的阻斷作用。
將感興趣基因的啟動(dòng)因子與熒光素酶相連接，并將其穩(wěn)定整合到染色體中，與這個(gè)基因平行表達(dá)，構(gòu)建出將此基因光學(xué)標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。通過(guò)這種方法，可以直接觀察這個(gè)基因表達(dá)的數(shù)量，時(shí)間，部位、和影響其表達(dá)的因素。這些動(dòng)物模型已大量用于病理研究，藥物研發(fā)和藥物篩選等領(lǐng)域中。例如，Zhang等構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因鼠(iNos-luc)，研究可誘導(dǎo)的NO合成酶(iNOS)在急慢性免疫反應(yīng)中的作用，并以此對(duì)多種化合物進(jìn)行了抗免疫反應(yīng)的測(cè)試和篩選。另外構(gòu)建的VGEF2啟動(dòng)子控制的Luc轉(zhuǎn)基因鼠，用來(lái)研究創(chuàng)傷恢復(fù)和腫瘤血管生成。他們還構(gòu)建了由神經(jīng)膠質(zhì)纖維蛋白GFAP啟動(dòng)子引導(dǎo)的Luc轉(zhuǎn)基因鼠，用來(lái)研究神經(jīng)損傷及老年癡呆綜合癥（Alzheimer Disease）。另外，一系列藥物代謝酶（如p450）啟動(dòng)子控制的Luc轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在藥代動(dòng)力學(xué)及毒理研究方面也開始發(fā)揮作用，成為研究藥物作用機(jī)制及藥效的重要方法。
最近，將活體動(dòng)物成像技術(shù)應(yīng)用于蛋白蛋白相互作用及細(xì)胞凋亡的研究取得了很大進(jìn)展。 Paulmurugan等將胰島素樣生長(zhǎng)因子II (IGF-II)與胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白6(IGFBP-6)分別用GFP及Renilla熒光素酶基因融合，研究它們之間在活體動(dòng)物體內(nèi)的相互作用。另一種觀察活體動(dòng)物體內(nèi)兩種蛋白質(zhì)相互作用的原理是將熒光素酶基因分成兩段，分別連接上所研究的兩種蛋白基因。當(dāng)這兩種研究的蛋白相互作用時(shí)，熒光素酶的兩部分相互靠近形成有活性的熒光素酶，在有底物存在時(shí)出現(xiàn)生物發(fā)光。此方法亦被用于研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等。

綜述文獻(xiàn)見(jiàn)附件。

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