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siyuansing銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
酶切問題 已有2人參與
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T載體插入了500bp的片段，T載體是takara的pMD19（simple）2692bp，無酶切位點，目的基因兩段構(gòu)建有EcoR I和Xba I兩個酶切位點。單酶切沒有效果，雙酶切表現(xiàn)出了單酶切的效果。如圖，從左向右分別是：1000marker，質(zhì)粒跑膠結(jié)果，雙酶切效果，EcoR I單酶切，Xba I單酶切；最右是5000的maker。 雙酶切體系試過兩個，效果都如同圖中一樣： EcoR I：1μl EcoR I：1μl Xba I：1μl Xba I：1μl x10 M buffer：2μl x10 M buffer：2μl BSA：2μl DNA（300ng/μl）：3μl DNA（300ng/μl）：3μl DEPC水：16μl DEPC水：13μl 酶都是takara的限制性內(nèi)切酶，酶切條件都是37℃，12h。 EcoR I的酶切體系為： EcoR I：1μl x10 H buffer：2μl DEPC水：17μl Xba I的酶切體系為： Xba I：1μl x10 M buffer：2μl BSA：2μl DEPC水：15μl 單酶切體系都是根據(jù)說明書上配的，雙酶切體系是根據(jù)說明書中雙酶切反應(yīng)使用表配的。 搞不懂為什么單酶切沒有效果，雙酶切卻只表現(xiàn)出了單酶切的效果。另外，質(zhì)�？偞笮�(yīng)該是3100bp左右，沒有切開的質(zhì)粒會跑出兩條帶么？而且跑膠結(jié)果的大小遠大于3100bp。 請大家?guī)兔饣螅x謝大家了。 PC 2016-01-16 14 時 21 分副本.jpg |
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siyuansing: 金幣+30, ★★★★★最佳答案 2016-01-23 09:32:51
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重新設(shè)計一下XbaI那邊的引物就好了！沒必要去買那種甲基化酶缺失的感受態(tài)！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
siyuansing9樓2016-01-18 10:12:33
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2樓2016-01-16 15:22:50
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3樓2016-01-16 15:25:22
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siyuansing: 回帖置頂 2016-01-17 12:49:44
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XbaI受dam甲基化影響嚴重，我記得識別序列為TCTAGA，如果酶切位點前面為GA或者后面為TC，就肯定切不開！ECORI我不太記得了，好好看看！都是常用酶，一般是因為疏忽了這種問題導(dǎo)致的！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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4樓2016-01-16 15:38:37
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