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肉肉肉.鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
畢赤酵母表達(dá)疏水蛋白 已有1人參與
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各位大神好，轉(zhuǎn)眼都要大二下學(xué)期了，但是蛋白還是沒(méi)表達(dá)出來(lái)，很是焦慮！懇請(qǐng)各位做過(guò)畢赤酵母表達(dá)蛋白的大神賜教！ 我要表達(dá)的是真菌當(dāng)中的一種疏水蛋白，提取了真菌的RNA后反轉(zhuǎn)錄，從NCBI中獲得該蛋白的CDS區(qū)域之后設(shè)計(jì)引物從cDNA中PCR除了該蛋白的基因序列。 然后去除了它的自身信號(hào)肽，將它連到了ppic9k載體和pPICZA中，分別進(jìn)行胞外和胞內(nèi)表達(dá)，用的是EcoR1和Not1酶切位點(diǎn)。 ppic9k是將片段直接插入到這兩個(gè)酶切位點(diǎn)，pPICZA中為了防止移碼突變?cè)谀康钠蔚慕K止子后面通過(guò)引物設(shè)計(jì)加入了一個(gè)密碼子A。 這兩個(gè)表達(dá)載體都通過(guò)引物在蛋白的C端加了6XHis標(biāo)簽，然后將表達(dá)載體分別用Sal1和Sac1線性化后電轉(zhuǎn)，篩選轉(zhuǎn)化子， 提取酵母基因組鑒定成功后誘導(dǎo)，誘導(dǎo)就是根據(jù)誘導(dǎo)手冊(cè)一步步來(lái)，然后跑了SDS-PAGE也做了Western，蛋白膠的話跟對(duì)照無(wú)差別，但是WB沒(méi)有做出來(lái)， WB的一抗是his標(biāo)簽抗體，蛋白膠的話蛋白上清和破碎液都做了，都沒(méi)結(jié)果，現(xiàn)在不知道哪里出了問(wèn)題！��！快焦慮死了！好想退學(xué)��！老板天天催�。�！ 我是真的沒(méi)有發(fā)現(xiàn)哪里有問(wèn)題啊各位大神�。�！為啥別人表達(dá)一個(gè)蛋白都跟玩兒似的到我這里就這么難�。�！ 我都做了兩遍表達(dá)了好多批！就是沒(méi)有！�。『孟胪藢W(xué)�。。。。。。� 現(xiàn)在有個(gè)疑慮就是說(shuō)表達(dá)蛋白的疏水性是不是會(huì)影響蛋白的檢測(cè)，可是查閱文獻(xiàn)有表達(dá)類似的疏水蛋白也是一樣直接取上清進(jìn)行檢測(cè)并沒(méi)有做特殊處理 啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊�。。。≌娴氖遣粫�(huì)做了�。。。。。。。�！跪求大神來(lái)相救！�。。。。。。。。。�！ |
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 蛋白表達(dá)純化鑒定精華 |
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肉肉肉.
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7樓2016-01-16 20:43:16
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2樓2016-01-16 18:37:57
3樓2016-01-16 19:01:21
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4樓2016-01-16 19:23:46
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