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蛋白質(zhì)純化與結(jié)晶
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找到一些 蛋白質(zhì)純化與結(jié)晶（感謝生物秀），一起學習 獲得蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)的第一個瓶頸，就是制備大量純化的蛋白質(zhì)(>10 mg)，其濃度通常在10 mg/ml 以上，并以此為基礎(chǔ)進行結(jié)晶條件的篩選。運用重組基因的技術(shù)，將特定基因以選殖(clone)的方式嵌入表現(xiàn)載體(expression vector)內(nèi)，此一載體通常具有易于調(diào)控的特性。之后再將帶有特定基因的載體送入可快速生長的菌體中，如大腸桿菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)，在菌體快速生長的同時，也大量生產(chǎn)表現(xiàn)載體上的基因所解譯出之蛋白質(zhì)。一般而言純度越高的蛋白質(zhì)比較有機會形成晶體，因此純化蛋白質(zhì)的步驟就成為一個重要的決定因素。 在取得高純度的蛋白質(zhì)溶液后，接下來就是晶體的培養(yǎng)。蛋白質(zhì)晶體與其他化合物晶體的形成類似，是在飽和溶液中慢慢產(chǎn)生的，每一種蛋白質(zhì)養(yǎng)晶的條件皆有所差異，影響晶體形成的變量很多，包含化學上的變量，如酸堿度、沈淀劑種類、離子濃度、蛋白質(zhì)濃度等；物理上的變數(shù)，如溶液達成過飽和狀態(tài)的速率、溫度等；及生化上的變數(shù)，如蛋白質(zhì)所需的金屬離子或抑制劑、蛋白質(zhì)的聚合狀態(tài)、等電點等，皆是養(yǎng)晶時的測試條件。截至目前為止，并無一套理論可以預測結(jié)晶的條件，所以必須不斷測試各種養(yǎng)晶溶液的組合后，才可能得到一顆完美的單一晶體 。 蛋白質(zhì)晶體的培養(yǎng)，通常是利用氣相擴散法(Vapor Diffusion Method) 的原理來達成；也就是將含有高濃度的蛋白質(zhì)(10-50 mg/ml)溶液加入適當?shù)娜軇�，慢慢降低蛋白質(zhì)的溶解度，使其接近自發(fā)性的沈淀狀態(tài)時，蛋白質(zhì)分子將在整齊的堆棧下形成晶體。舉例來說，我們將蛋白質(zhì)溶于低濃度(~1.0 M) 的硫酸銨溶液中，將它放置于一密閉含有高濃度(~2.0 M)硫酸銨溶液的容器中，由氣相平衡，可以緩慢提高蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨的濃度，進而達成結(jié)晶的目的。 蛋白質(zhì)晶體在外觀上與其他晶體并無明顯不同之處，但在晶體的內(nèi)部，卻有很大的差異。一般而言，蛋白質(zhì)晶體除了蛋白質(zhì)分子外，其他的空間則充滿約40 %至60 %之間的水溶液，其液態(tài)的成分不僅使晶體易碎，也容易使蛋白質(zhì)分子在晶格排列上有不規(guī)則的情形出現(xiàn)，造成晶體處理時的困難及繞射數(shù)據(jù)上的搜集不易等缺點。但也由于高含水量的特性，讓蛋白質(zhì)分子在晶體內(nèi)與水溶液中的狀態(tài)，極為相似。所以由晶體所解出的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，基本上可視為自然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)。 |
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xwnail2003
禁蟲 (著名寫手)
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2樓2016-01-17 22:06:45
xwnail2003
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
sty112: 金幣+5, 歡迎多多交流 2016-01-18 10:39:14
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sty112: 金幣+5, 歡迎多多交流 2016-01-18 10:39:14
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