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肉肉肉.鐵蟲 (小有名氣)
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有關(guān)pPICZA、pPIC9K酵母表達質(zhì)粒如何正確構(gòu)建載體表達蛋白 已有1人參與
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各位大神好，最近準備用pPICZA和pPIC9K表達一個酶，由于之前沒有成功表達蛋白，所以想請教大家。 首先我在NCBI上找到我的酶的CDS區(qū)域，包括ATG和終止子，然后準備把完整的CDS區(qū)域連接到酵母表達載體pPICZA和pPIC9K上面，分別試著進行胞外和胞內(nèi)表達。 1.想請問一下這個做法正確嗎？要想表達一個蛋白是否只需要把它的CDS區(qū)域連入表達質(zhì)粒然后在酵母中同源重組誘導后就能表達？ 2.還有就是為了防止移碼突變，我該如何將我完整的CDS區(qū)域插入這兩個載體中？從載體的AOX啟動子那邊開始閱讀的話到底從哪里開始算起？ 3.pPICZA這個載體手冊里面寫到說插入的片段必須含有ATG這個起始子作為酵母共識別序列的一部分，我插入目的蛋白完整的CDS開頭就含有ATG，是否還需要添加一個ATG？ 4.pPICZA這個載體使用說明里面還說道，要將你的基因表達為一個重組的融合蛋白的話，必須是你的基因與C端多肽（c-myc,組氨酸純化標簽）讀碼框一致，這樣的話是不是說只要使插入的完整的CDS基因片段與后面的標簽讀碼框一致，即3個3個翻譯順序一致就行了？那還需要考慮上游AOX的讀碼框順序嗎？ 5.pPIC9K這個載體說明書里面說目的基因的ORF（開放式閱讀框）要與α-factor signal sequence這個信號肽序列讀碼框一致并且在它的下方，請問這個ORF就是我在NCBI里面找到的CDS區(qū)域嗎？這里還需要考慮AOX閱讀的問題嗎？ 由于分子基礎(chǔ)知識為零，真的麻煩大神指點一下��！ ppicza.png |
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 蛋白表達純化鑒定精華 |
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2樓2016-01-18 21:58:27
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3樓2016-01-19 11:47:38
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4樓2016-01-19 13:14:30
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5樓2016-01-19 14:57:40
6樓2016-10-15 21:31:24
【答案】應(yīng)助回帖
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肉肉肉.: 金幣+50, ★★★★★最佳答案, 雖然已經(jīng)解決了但還是感激！ 2016-10-16 13:19:32
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不用考慮axo序列，有atg就不用額外加了 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2016-10-15 21:32:37
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