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那雨那女孩新蟲 (小有名氣)
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[求助]
有關(guān)無縫克隆的，求助！�。�！ 已有2人參與
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我最近要做無縫克隆，有以下問題，請各位大神幫忙，謝謝��！ 1：獲得線性載體的話，是用一種酶切，還是用兩種酶切？ 酶切之后都要割膠回收嗎？ 2：無縫克隆的時(shí)候，需要考慮目的基因會不會移碼這個(gè)問題嗎？（這個(gè)是最重要的） 3：無縫克隆的時(shí)候，設(shè)計(jì)引物時(shí)，與線性載體重合的部分應(yīng)該是是下圖中 紅色的一組 還是綠色的一組？ 請各位指導(dǎo)，謝謝�。。。�！ 問題3圖.PNG |
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5樓2016-01-20 08:44:12
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10樓2016-02-29 16:30:13
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【答案】應(yīng)助回帖
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那雨那女孩: 金幣+15, ★★★很有幫助, 謝謝�。〉�3個(gè)問題，我畫了一下，發(fā)現(xiàn)太白癡了。謝謝�。。� 2016-01-19 16:04:56
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那雨那女孩: 金幣+15, ★★★很有幫助, 謝謝�。〉�3個(gè)問題，我畫了一下，發(fā)現(xiàn)太白癡了。謝謝�。。� 2016-01-19 16:04:56
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1. 我推薦雙酶切，因?yàn)殡p酶切可以最大程度避免載體自連，無縫克隆酶中有的會有連接酶存在。建議跑電泳，并做空白對照以確保切開。如果您的質(zhì)粒不太大，我非常推薦使用反向PCR方式進(jìn)行載體線性化，這樣假陽性比較少。 2.一般基因都是自帶ATG的吧，所以一般不需要考慮移碼，如果是從質(zhì)粒上的ATG開始翻譯，那么需要考慮移碼問題了。具體地方式跟傳統(tǒng)的酶切連接是一樣的。 3. 紅色還是綠色我看不太懂，紅色的應(yīng)該跟質(zhì)粒序列一樣對吧，那就把紅色的那段序列放到基因正向引物前面，后面紅色那段方向互補(bǔ)之后，放到基因反向引物的前面就ok了 |
2樓2016-01-19 15:22:40
那雨那女孩
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3樓2016-01-19 19:04:41
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4樓2016-01-19 19:07:00
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6樓2016-01-20 08:45:51
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7樓2016-01-20 09:52:27
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那雨那女孩: 金幣+15, ★★★很有幫助, 謝謝�。�！ 2016-01-23 13:54:41
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| 最近剛做完Seamless，酶切位點(diǎn)的選擇是雙酶切；其次最為關(guān)鍵的就是同源臂的設(shè)計(jì)，在此基礎(chǔ)上加上你的目的基因引物，高保真PCR擴(kuò)增后回收片段，當(dāng)然在此之間要考慮移碼的問題，目的基因3端根據(jù)需要考慮是否加終止密碼子；最后紅綠代表的意思沒看太明白，簡單地說，同源臂有兩個(gè)，其實(shí)就可以把它們看成一對引物，這樣就簡單多了。祝好 |
8樓2016-01-21 01:04:30
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嗯嗯，謝謝！我想問一下，由于酶切有一個(gè)同源臂是少了幾個(gè)堿基的，就是和目的基因之間有5,6個(gè)堿基的gap，pcr時(shí)有關(guān)系嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2016-01-22 10:35:09
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