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日升西山鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
鏈霉菌的 DNA 提取 已有1人參與
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畢設(shè)，老板讓提取鏈霉菌的 DNA 送去公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。先按照下面 protocal 做了，感覺(jué)細(xì)胞壁很厚無(wú)法破壁，第六步時(shí)壓根看不到 DNA 析出，跟我一起的同學(xué)提另一株菌（也是鏈霉菌）用同樣方法卻做出來(lái)了。我的菌生長(zhǎng)很快，不加甘氨酸一天就到對(duì)數(shù)期，加0.15%的甘氨酸也只要兩天；他的菌需要三四天才能長(zhǎng)好，而且需要靜止培養(yǎng)。 """ 1 菌體的收集：將液體培養(yǎng)的菌體先靜置直至出現(xiàn)分層，把上清液倒掉，倒入無(wú)菌水浸泡，待分層后傾去上清液，反復(fù)幾次，直至菌體變白，上清液幾乎和水一樣為止。將菌體3000 r/min低速離心，即得到下一步用的濕菌體； 2 用5 mL的SET緩沖液（含20 mmol/L Tris·HCl，pH 7.5，25 mmol/L EDTA，75 mmol/L NaCl）重懸菌體，加100 μL的溶菌酶溶液，37 °C水浴30-60 min。溶菌酶的終濃度是1 mg/Ml； 3 加140 μL的蛋白酶K溶液，混勻，加600 μL的10 %的SDS，顛倒混勻，55 °C 水浴2 h，其間不時(shí)地顛倒，一般10 min左右顛倒一次。蛋白酶K的終濃度 0.5 mg/mL，SDS 終濃度1 %; 4 加2 mL 5 M NaCl，上下顛倒徹底混勻，冷卻到37 °C。NaCl的終濃度1.25 M。加5 mL的氯仿，在20 °C顛倒混勻30 min; 5 4500 r/min 20 °C離心15 min; 6 將上清液轉(zhuǎn)到一個(gè)新管(15ml離心管)中，加0.6倍體積的異丙醇并不斷上下顛倒混勻，當(dāng)看到DNA析出后，把多余的液體倒掉，用75 %的乙醇沖洗DNA，再用無(wú)水乙醇來(lái)洗，最后風(fēng)干，然后在55 °C水浴將DNA溶解在1-2 mL的ddH2O（或TE）中; 7 加入RNase至20 μg/mL，37 °C水浴保溫30 min; 8 加入一倍體積的氯仿 : 異戊醇（24 : 1）輕搖混勻后，8000 r/min離心10 min; 9 將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入一倍體積的異丙醇，輕搖混合后，將沉淀出的DNA挑取到一個(gè)新的離心管中，用10 mL 70 %的乙醇洗滌兩次，吹干后裝入離心管置于-20 °C保存?zhèn)溆? """ 我又試了液氮研磨+CTAB法，但是還是提取不出來(lái)。 求助各位大神還有什么別的方法嗎，或者可以怎么改進(jìn)。 |
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2樓2016-05-25 09:51:15
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3樓2018-07-13 15:42:29
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