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[求助]
染色體步移 已有1人參與
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| 目前在利用takara的genome walking試劑盒克隆玉米中一段啟動(dòng)子序列，第一次利用AP1-4的時(shí)候均得到了1.3kb的產(chǎn)物，設(shè)計(jì)特異引物克隆這一段，已經(jīng)測序得到這一段序列。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行第二次walking，第三輪的GSP設(shè)計(jì)在距離第一次1.3kb 5‘端140bp的位置，這次AP1,3，4得到的產(chǎn)物相似，AP2得到產(chǎn)物略小約900bp，然后設(shè)計(jì)一對引物可以檢測出上面提到的140bp進(jìn)行初篩，結(jié)果只有AP2中所有克隆都含有這一段，克隆、測序、BLAST比對，900bp可以比對到染色體上相應(yīng)位置，并且與第一次的1.3kb可以重合。拼接后得到約2.0kb的區(qū)段，只需要對1.7kb的區(qū)段進(jìn)行研究，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增，在玉米B73中克隆到目的條帶，但是未知材料里沒有任何產(chǎn)物。請教一下各位，這是什么情況？明明兩輪WALKING得到的產(chǎn)物可以拼接上而且在未知材料中得到的1.7kb也可以比對到染色體上相應(yīng)位置，但是擴(kuò)增不出來，其中的1.3kb已經(jīng)得到證實(shí)，PCR體系及條件沒有問題，求解。 |
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但是后面第二次步移回收第二輪的產(chǎn)物就一直連不上t載體。測序要不是空載要不就只能找到引物序列 無重疊區(qū)。真是要瘋了……折騰很久了……要怎么改進(jìn)一下呢？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
7樓2016-04-14 02:01:48
bbaa5252
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