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Ritaaaaaa新蟲 (初入文壇)
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[求助]
用掛著酶切位點(diǎn)的引物跑PCR結(jié)果跑不出來(lái)�。⌒“浊缶劝�！ 已有4人參與
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要做HEK293表達(dá)一種GPCR，然后老板讓我試試直接用掛著酶切微店的引物跑PCR，已經(jīng)試了9次了，一直不成功。 引物： F： GCC 酶切位點(diǎn) 序列前端25bp R： 序列末端25bp 酶切位點(diǎn) CCG 片段長(zhǎng)是2078bp, ORF 1688bp 用的LA Taq. PCR 程序試過(guò)很多種，推薦的2 step 和正常的3step， 還有各種退火溫度都試過(guò)了。 也試過(guò)用PCR產(chǎn)物為模板再跑一次PCR了,就是看不到條帶啊。 其中有一次看到條帶了，結(jié)果小于1600bp. 已經(jīng)耽誤了好多天了，求救啊師兄師姐們， 研一的小白要瘋掉了。 |
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leisure797
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
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2樓2016-01-25 10:19:31
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3樓2016-01-25 10:47:57
Ritaaaaaa
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4樓2016-01-25 20:25:09
noblefire
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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gpcr是真核的基因，你用的模板是cDNA么？可能是模板的問(wèn)題，因?yàn)橛胏DNA一般很容易擴(kuò)增。你用的酶幾乎是最好的了，雖然大材小用了。 實(shí)在不行先設(shè)計(jì)一段500bp的片段(介于你的酶比引物貴多了)，擴(kuò)增一下看看模板有沒(méi)有問(wèn)題。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2016-01-25 21:08:20
noblefire
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6樓2016-01-25 21:10:15
7樓2016-01-25 23:46:57
zhufadi
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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你的r引物出問(wèn)題了，把酶切位點(diǎn)掛r引物的5,端吧，拿著引物問(wèn)問(wèn)實(shí)驗(yàn)室的師兄師姐們?nèi)グ桑?br />
發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
8樓2016-01-25 23:51:44
buthey
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你上下游引物直接用的這段序列的前端和末端，然后加上了酶切位點(diǎn)么？ 你的引物符合引物設(shè)計(jì)的規(guī)則不 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2016-01-26 00:21:25
jiangzz555
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10樓2016-01-26 01:21:14
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