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霜落雪鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
pET-30a原核蛋白表達疑問 已有1人參與
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新手剛做原核蛋白表達，有許多不明白的地方請教。 1.pET-30a上本身帶有兩個組氨酸標簽，我以后純化蛋白時要用到組氨酸標簽。但是不知道是兩個組氨酸標簽都留著好還是只留一個好，要是只留一個留哪個呢？還是說根據(jù)蛋白大小決定？看到很多前輩說到純化時掛不上柱子，是不是就和這里組氨酸標簽的選擇有關(guān)系呢？ 2.看到一些帖子說到以后還要去除組氨酸標簽，為什么呢？ 2.是否需要自己添加終止子？ 3.蛋白的大小控制在多大合適呢？最終是打算讓蛋白入核的。 |
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【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
霜落雪: 金幣+5, ★★★很有幫助 2016-02-25 13:05:54
感謝參與，應助指數(shù) +1
霜落雪: 金幣+5, ★★★很有幫助 2016-02-25 13:05:54
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個人理解如下： 1.pET-30a上本身帶有兩個組氨酸標簽，我以后純化蛋白時要用到組氨酸標簽。但是不知道是兩個組氨酸標簽都留著好還是只留一個好，要是只留一個留哪個呢？還是說根據(jù)蛋白大小決定？看到很多前輩說到純化時掛不上柱子，是不是就和這里組氨酸標簽的選擇有關(guān)系呢？ 看蛋白構(gòu)象，哪端暴露在外面就留哪端的標簽。如果要留C端的標簽（記得是從N端開始表達），那么自己基因的終止子就要去掉，要不標簽就不表達了。 2.看到一些帖子說到以后還要去除組氨酸標簽，為什么呢？ 這個主要看表達后做什么用吧，有的帶有酶切位點還能切掉，沒有的話，不好去除吧。 2.是否需要自己添加終止子？ 把目的基因插入到多克隆位點，用自己基因的終止子，或把自己的終止子去掉用載體上的。 3.蛋白的大小控制在多大合適呢？最終是打算讓蛋白入核的。 這個不清楚，你表達的蛋白還能控制嗎，還是可以只表達某個結(jié)構(gòu)域。 建議所有問題都考慮清楚，理解原理后再開始試驗，要不可能會返工的。 |
2樓2016-02-25 12:16:20
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