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yanshuai511銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
GPCR蛋白N端連flag不表達！急！
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| FLAG 連在G 蛋白耦連的受體的N端，做了兩個月了還是沒有進展。測序是正確的，也沒有移碼�？蓋estern就是檢測不到FLAG的表達。受體的ATG帶著和不帶著我都做了，也不表達。轉染的時間24h和48h我也做過了。載體也換過，還是不表達。我看有的文章說GPCR，有的是有糖基化，所以會影響融合蛋白表達的位置。有沒有做過給G蛋白耦連受體連flag的大神，幫忙分析一下。 |
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haofeng0804
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11樓2015-01-05 10:44:25
chenliang_0513
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【答案】應助回帖
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既然測序是正確的，那就應該ORF沒用問題。WB做不出來的原因很多的。先手我不知道你在哪兒表達的，難道是酵母？還怕出現(xiàn)糖基化……如果是酵母一般不需要用wb吧，考染就看的見的；大腸桿菌表達系統(tǒng)一般也不需要。估計你用的還是真核表達系統(tǒng)。 那么你先要注意自己的載體是不是可以在真核細胞中表達？（含真核的啟動子，終止序列等）以前用這個載體做過其他的基因表達沒有？就是最好有正對照 其次，你最好頂一個beta-actin或GAPDH的抗體，做內參，煮的細胞就可以，如果能做出來，證明wb的操作沒有問題，如果做不出來很可能就是操作的問題 我不知道你的抗體是哪個公司的，推薦用sigma的那個M4的鼠源的單抗，有些公司的不好用，效價很低 如果還有問題，再聯(lián)系我吧，祝實驗順利！ |
2樓2012-07-15 16:20:07
yanshuai511
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3樓2012-07-15 16:30:42
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4樓2012-07-15 16:36:28
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