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yanshuai511銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
GPCR蛋白N端連flag不表達(dá)！急！
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| FLAG 連在G 蛋白耦連的受體的N端，做了兩個月了還是沒有進(jìn)展。測序是正確的，也沒有移碼。可western就是檢測不到FLAG的表達(dá)。受體的ATG帶著和不帶著我都做了，也不表達(dá)。轉(zhuǎn)染的時間24h和48h我也做過了。載體也換過，還是不表達(dá)。我看有的文章說GPCR，有的是有糖基化，所以會影響融合蛋白表達(dá)的位置。有沒有做過給G蛋白耦連受體連flag的大神，幫忙分析一下。 |
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12樓2015-07-02 22:28:56
chenliang_0513
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既然測序是正確的，那就應(yīng)該ORF沒用問題。WB做不出來的原因很多的。先手我不知道你在哪兒表達(dá)的，難道是酵母？還怕出現(xiàn)糖基化……如果是酵母一般不需要用wb吧，考染就看的見的；大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)一般也不需要。估計你用的還是真核表達(dá)系統(tǒng)。 那么你先要注意自己的載體是不是可以在真核細(xì)胞中表達(dá)？（含真核的啟動子，終止序列等）以前用這個載體做過其他的基因表達(dá)沒有？就是最好有正對照 其次，你最好頂一個beta-actin或GAPDH的抗體，做內(nèi)參，煮的細(xì)胞就可以，如果能做出來，證明wb的操作沒有問題，如果做不出來很可能就是操作的問題 我不知道你的抗體是哪個公司的，推薦用sigma的那個M4的鼠源的單抗，有些公司的不好用，效價很低 如果還有問題，再聯(lián)系我吧，祝實驗順利！ |
2樓2012-07-15 16:20:07
yanshuai511
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4樓2012-07-15 16:36:28
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5樓2012-07-15 16:46:55
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