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maggie3277木蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】蛋白誘導表達不出目標條帶 已有22人參與
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| 請教各位蟲友，最近做重組蛋白的表達。但在大腸桿菌內重組的pet28a總表達不出我的目標條帶，IPTG誘導濃度也設置了梯度，溫度也設定了梯度。但就是沒有我的目標條帶的生成。請問有蟲友遇到過類似情況，構建好的質粒卻表達不出條帶的情況嗎？ |
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5樓2010-07-24 09:11:43
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silicare(金幣+1):謝謝參與 2010-09-19 12:43:23
silicare(金幣+1):謝謝參與 2010-09-19 12:43:23
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pET28a我正在是用，給出幾點建議，LZ可以嘗試一下： 1、對表達載體再次測序，確定整個ORF的正確性（要從載體最前端含有標簽的起始位置到終止子部分）。確定載體沒有問題（其他基因使用時候可以表達）； 2、441個氨基酸中有37個稀有密碼子也無需大驚小怪，關鍵問題是只要沒有兩個或者三個以上稀有密碼子串聯出現。如果擔心稀有密碼子問題可以考慮使用Rosetta菌柱系列； 3、建議試誘導的條件為37℃ 1mM IPTG誘導4h。分別取誘導前和誘導后個200微升，加入40微升Loading buffer ，上樣前高速離心10min。上樣16-18微升，對比誘導前后有沒有明顯的差異條帶； 4、如果上述步驟沒有看到明顯的差異條帶，而測序顯示閱讀框沒有任何問題，建議擴大培養(yǎng)。一次培養(yǎng)200ml-1L的菌液，使用親和柱富集。然后從柱子上洗脫，看有沒有目的蛋白。有時候表達量第，需要富集后才能看到有目的蛋白的表達。 還不行就嘗試更換載體。 |
33樓2010-08-04 18:52:54
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