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maggie3277

木蟲(chóng) (小有名氣)

引用回帖:
Originally posted by chemifunan at 2010-07-28 18:45:32:
不是吧 樓主 37個(gè)還不多啊 很多了 你把你現(xiàn)在的載體轉(zhuǎn)到RocettaBL21里表達(dá)看看 km50再加cm25 37度先試試

另外28樓的同學(xué) 表達(dá)不表達(dá)是看基因的來(lái)源是不適合大腸桿菌 是否包涵體是看折疊過(guò)程是否正常 這是對(duì)sol ...

我的蛋白是剪切了信號(hào)肽的基因,來(lái)源不知,只知道是某細(xì)菌的一段基因片段。但是是有完整開(kāi)讀框的。
31樓2010-07-28 20:04:53
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周_yan

木蟲(chóng) (小有名氣)


小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包,謝謝回帖交流
引用回帖:
Originally posted by maggie3277 at 2010-07-27 10:08:46:

恩,現(xiàn)在已經(jīng)又送去測(cè)序啦!還不知道結(jié)果怎么樣。

現(xiàn)在測(cè)序結(jié)果應(yīng)該出來(lái)了吧,怎么樣。坑袥](méi)有終止密碼子?
32樓2010-08-04 10:06:54
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月月大可

木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)


silicare(金幣+1):謝謝參與 2010-09-19 12:43:23
pET28a我正在是用,給出幾點(diǎn)建議,LZ可以嘗試一下:
1、對(duì)表達(dá)載體再次測(cè)序,確定整個(gè)ORF的正確性(要從載體最前端含有標(biāo)簽的起始位置到終止子部分)。確定載體沒(méi)有問(wèn)題(其他基因使用時(shí)候可以表達(dá));
2、441個(gè)氨基酸中有37個(gè)稀有密碼子也無(wú)需大驚小怪,關(guān)鍵問(wèn)題是只要沒(méi)有兩個(gè)或者三個(gè)以上稀有密碼子串聯(lián)出現(xiàn)。如果擔(dān)心稀有密碼子問(wèn)題可以考慮使用Rosetta菌柱系列;
3、建議試誘導(dǎo)的條件為37℃ 1mM IPTG誘導(dǎo)4h。分別取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后個(gè)200微升,加入40微升Loading buffer ,上樣前高速離心10min。上樣16-18微升,對(duì)比誘導(dǎo)前后有沒(méi)有明顯的差異條帶;
4、如果上述步驟沒(méi)有看到明顯的差異條帶,而測(cè)序顯示閱讀框沒(méi)有任何問(wèn)題,建議擴(kuò)大培養(yǎng)。一次培養(yǎng)200ml-1L的菌液,使用親和柱富集。然后從柱子上洗脫,看有沒(méi)有目的蛋白。有時(shí)候表達(dá)量第,需要富集后才能看到有目的蛋白的表達(dá)。
    還不行就嘗試更換載體。
33樓2010-08-04 18:52:54
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maggie3277

木蟲(chóng) (小有名氣)

引用回帖:
Originally posted by 周_yan at 2010-08-04 10:06:54:




現(xiàn)在測(cè)序結(jié)果應(yīng)該出來(lái)了吧,怎么樣。坑袥](méi)有終止密碼子?

序列是沒(méi)問(wèn)題的。
34樓2010-08-05 11:17:32
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xingxing342

銀蟲(chóng) (小有名氣)


小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包,謝謝回帖交流
我用PET-28 PET-30都沒(méi)表達(dá)出來(lái),用PGEX就可以,但PGEX標(biāo)簽太大。
35樓2010-08-10 10:14:25
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sqhnsd

金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

★ ★
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包,謝謝回帖交流
silicare(金幣+1):謝謝參與 2010-09-19 12:43:35
可能你的基因根本不在Ecoli表達(dá)。但是要回答這個(gè)問(wèn)題,你首先要確定:
1.測(cè)序是否正確?
2.即使有信號(hào)肽,標(biāo)簽是在N-terminal or C-terminal,如果前者,應(yīng)該不會(huì)分泌表達(dá)。
3.是否是沉淀?
如果不是,可以考慮用GST-tag的標(biāo)簽,GST比較大,蛋白得可溶性和可表達(dá)性都會(huì)增加(這個(gè)原理貌似大的標(biāo)簽使蛋白在翻譯的時(shí)候很容易通過(guò),這個(gè)只是別人的經(jīng)驗(yàn))
36樓2010-08-10 10:27:00
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noheartman

金蟲(chóng) (小有名氣)


小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包,謝謝回帖交流
遇到過(guò)這樣的情況,你以為連接到表達(dá)載體上就表達(dá)啊,不是這樣的,要嘗試不同的載體、不同的表達(dá)菌株及優(yōu)化表達(dá)條件,后面的天地還寬著呢!
37樓2010-08-10 15:31:35
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mengyu615

金蟲(chóng) (初入文壇)


小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包,謝謝回帖交流
你重組的目的基因是什么,片段有多長(zhǎng)呢??
希望結(jié)識(shí)更多的你們。。。
38樓2010-09-19 10:50:51
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丙氨酸密碼子

新蟲(chóng) (小有名氣)


小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包,謝謝回帖
lz
時(shí)隔一年 你的蛋白表達(dá)出來(lái)了嘛?

我最近開(kāi)始的蛋白誘導(dǎo)表達(dá),
一共兩個(gè),誘導(dǎo)出一個(gè),另外一個(gè)換了含稀有密碼子的菌株還沒(méi)誘導(dǎo)表達(dá)出來(lái),, 你的稀有密碼子含量有8.4% 應(yīng)該算比較高的了,
我想嘗試做自誘導(dǎo)了,,但是我們實(shí)驗(yàn)室都沒(méi)有人做過(guò),那些培養(yǎng)基所需要的成分,我們實(shí)驗(yàn)室基本沒(méi)有的,再問(wèn)師兄買(mǎi)東西,估計(jì),,,,哎,,
39樓2011-11-21 16:41:53
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beibei9535

榮譽(yù)版主 (職業(yè)作家)

暈暈小版主~ 姑娘你好!

優(yōu)秀版主優(yōu)秀版主

★ ★ ★
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包,謝謝回帖
wanhscn(金幣+2): 鼓勵(lì)交流 2011-11-22 10:46:44
引用回帖:
8樓: Originally posted by maggie3277 at 2010-07-24 12:52:45:
我是用Signal P預(yù)測(cè)的,然后將序列的信號(hào)肽去除連接上表達(dá)載體的,這個(gè)會(huì)影響蛋白的表達(dá)嘛?
我就是表達(dá)個(gè)蛋白測(cè)酶活的,蛋白也不是很大的。
[ Last edited by maggie3277 on 2010-7-24 at 12:54 ]

去掉是對(duì)的。去掉更好。

誘導(dǎo)時(shí)候加入cam。
最好的年齡是,那一天,終于知道并且堅(jiān)信自己有多好,不是虛張,不是夸浮,不是眾人捧,是內(nèi)心明明澈澈知道:是的,我就是這么好。
40樓2011-11-21 19:59:11
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