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maggie3277

木蟲 (小有名氣)

引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-07-26 14:24:44:
做什么原核呢,~啊~

啊?大腸桿菌……
21樓2010-07-27 10:09:30
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maggie3277

木蟲 (小有名氣)

引用回帖:
Originally posted by chemifunan at 2010-07-26 21:14:35:
當然有這種情況了 不表達 換一下載體 用MAL融合看看
這是蛋白異源表達性質決定的 樓主你確定你的測序 讀碼和連接沒問題的情況下 與誘導時間和表達溫度都無關的

恩,同感,再不行,我就要重新構建啦!
得研究下融合表達的相關知識了,以前沒做過。
22樓2010-07-27 10:12:07
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chemifunan

木蟲 (正式寫手)

海王小木蟲

★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包,謝謝回帖交流
scelab(金幣+3):歡迎多來交流!:tiger06: 2010-07-27 23:37:03
一樣的 融合是自動的 只是切切連連再構建個質粒而已 pET系列就有 pET多少我忘了 Nus MAL和GST都可以試試看
目標蛋白如果表達 大小就變了 是增加后的大小
37度誘導的上個對照看就行 不用marker
Bemühen Sie !
23樓2010-07-27 10:51:39
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chemifunan

木蟲 (正式寫手)

海王小木蟲

★ ★
scelab(金幣+2):歡迎多來交流!:tiger06: 2010-07-27 23:37:10
對了 分析稀有密碼子了么? 你的基因是什么生物來源的? 分析一下大腸的密碼子 實在不行用現(xiàn)在的construct轉一下Rocetta

是一點不表達還是表達出來大小長短不對短一截?
Bemühen Sie !
24樓2010-07-27 10:53:04
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chemifunan

木蟲 (正式寫手)

海王小木蟲

★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包,謝謝回帖交流
scelab(金幣+5):歡迎多來交流!:tiger06: 2010-07-27 23:37:40
樓主啊 你還沒測完序BLAST就先把載體構建啦 別著急么 測完序BLAST功能了再說
你確定你克隆到的已經是一個基因沒有其他序列了?
16樓的同學 剛看到 是2k吧 2千k沒這么大的基因 2k不是很大 蛋白八九十kD吧
我想問16樓的同學 小了幾kD是怎么看出來的?
2k基因一般對應八九十kD的蛋白 跑PAGE怎么看出來只小了幾kD
目標蛋白只要和誘導的對照對上了 和Marker稍有偏差是沒關系的 除非質譜或蛋白測序才能較精確的定分子量
Bemühen Sie !
25樓2010-07-27 10:59:17
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maggie3277

木蟲 (小有名氣)

引用回帖:
Originally posted by chemifunan at 2010-07-27 10:53:04:
對了 分析稀有密碼子了么? 你的基因是什么生物來源的? 分析一下大腸的密碼子 實在不行用現(xiàn)在的construct轉一下Rocetta

是一點不表達還是表達出來大小長短不對短一截?

441個氨基酸含有37個稀有密碼子的氨基酸殘基,也不是太高吧?
26樓2010-07-27 19:26:03
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劉小樂

銅蟲 (小有名氣)

★ ★
scelab(金幣+2):鼓勵新蟲!歡迎多來交流!:tiger06: 2010-07-27 23:37:52
1、還是先試試其他質粒吧,我也覺得28不怎么好的 ;
2、受體菌可以換用稀有密碼子補加(plus)的菌種看看效果
互動互利互相學習
27樓2010-07-27 19:39:46
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noheartman

金蟲 (小有名氣)

★ ★ ★ ★
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scelab(金幣+3):謝謝交流!:tiger06: 2010-07-27 23:38:00
構建好的表達載體在大腸桿菌中不一定會表達的,就算你優(yōu)化表達時間,IPTG的濃度或其他的,我做的是膜蛋白,pET28a就不怎么表達,或者以包涵體的形式表達。你可以試著進行一些N末端的修飾,看看有沒有一定的效果。不過總的來說,通過優(yōu)化表達條件基本是行不通的,換個載體也許行。
28樓2010-07-27 21:58:57
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maggie3277

木蟲 (小有名氣)

引用回帖:
Originally posted by noheartman at 2010-07-27 21:58:57:
構建好的表達載體在大腸桿菌中不一定會表達的,就算你優(yōu)化表達時間,IPTG的濃度或其他的,我做的是膜蛋白,pET28a就不怎么表達,或者以包涵體的形式表達。你可以試著進行一些N末端的修飾,看看有沒有一定的效果。 ...

再不行的話,真的要換載體了,我要抓狂了。
29樓2010-07-28 09:29:48
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chemifunan

木蟲 (正式寫手)

海王小木蟲


小木蟲(金幣+0.5):給個紅包,謝謝回帖交流
不是吧 樓主 37個還不多啊 很多了 你把你現(xiàn)在的載體轉到RocettaBL21里表達看看 km50再加cm25 37度先試試

另外28樓的同學 表達不表達是看基因的來源是不適合大腸桿菌 是否包涵體是看折疊過程是否正常 這是對soluble蛋白
膜蛋白比較特殊 即使折疊正確也會沉淀 膜蛋白是大腸來源的同源高表達最好做 表達完了會附著在自己的膜上 高速離心分離 如果其他來源的 會直接是包涵體 把包涵體分出來 溶在相應的detergent溶液里就好了

N端保守型高一點 通常N端折疊不正常會導致整個蛋白表達效果失敗 看樓主的基因是什么來源了 有些基因表達后在宿主內有后修飾 大腸不具備就不會很好表達

現(xiàn)今策略 試試pMAL等融合載體 再就是原有載體換個菌種 用rocetta看看

另外問一下 樓主你的基因是完整的基因還是truncated的基因
Bemühen Sie !
30樓2010-07-28 18:45:32
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