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maggie3277木蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】蛋白誘導(dǎo)表達(dá)不出目標(biāo)條帶 已有22人參與
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| 請教各位蟲友，最近做重組蛋白的表達(dá)。但在大腸桿菌內(nèi)重組的pet28a總表達(dá)不出我的目標(biāo)條帶，IPTG誘導(dǎo)濃度也設(shè)置了梯度，溫度也設(shè)定了梯度。但就是沒有我的目標(biāo)條帶的生成。請問有蟲友遇到過類似情況，構(gòu)建好的質(zhì)粒卻表達(dá)不出條帶的情況嗎？ |
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5樓2010-07-24 09:11:43
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silicare(金幣+1):謝謝參與 2010-09-19 12:43:23
silicare(金幣+1):謝謝參與 2010-09-19 12:43:23
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pET28a我正在是用，給出幾點建議，LZ可以嘗試一下： 1、對表達(dá)載體再次測序，確定整個ORF的正確性（要從載體最前端含有標(biāo)簽的起始位置到終止子部分）。確定載體沒有問題（其他基因使用時候可以表達(dá)）； 2、441個氨基酸中有37個稀有密碼子也無需大驚小怪，關(guān)鍵問題是只要沒有兩個或者三個以上稀有密碼子串聯(lián)出現(xiàn)。如果擔(dān)心稀有密碼子問題可以考慮使用Rosetta菌柱系列； 3、建議試誘導(dǎo)的條件為37℃ 1mM IPTG誘導(dǎo)4h。分別取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后個200微升，加入40微升Loading buffer ，上樣前高速離心10min。上樣16-18微升，對比誘導(dǎo)前后有沒有明顯的差異條帶； 4、如果上述步驟沒有看到明顯的差異條帶，而測序顯示閱讀框沒有任何問題，建議擴大培養(yǎng)。一次培養(yǎng)200ml-1L的菌液，使用親和柱富集。然后從柱子上洗脫，看有沒有目的蛋白。有時候表達(dá)量第，需要富集后才能看到有目的蛋白的表達(dá)。 還不行就嘗試更換載體。 |
33樓2010-08-04 18:52:54
小白3521
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2樓2010-07-23 23:28:47
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3樓2010-07-24 00:11:56
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+3):感謝分享經(jīng)驗~~ 2010-07-24 12:45:46
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lstt09nk(金幣+3):感謝分享經(jīng)驗~~ 2010-07-24 12:45:46
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我也遇到過一次，而且片段不是很長的那種。原來我用全長序列倒是表達(dá)出來了，只是量很低。后來就用了部分片段，沒想到，就沒有了。也不知道什么原因。 建議：首先保證測序正確（其實只要不發(fā)生移碼突變之類，也應(yīng)該表達(dá)出來�。荒愕男蛄惺遣皇怯邢∮忻艽a子；你的序列疏水區(qū)，信號肽，跨膜域這些都會影響表達(dá)；蛋白很大的話，也會影響它的表達(dá)。 不知道樓主是用來干什么呢？制備抗原，分析酶活？ |
4樓2010-07-24 08:04:55
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10樓2010-07-24 12:57:02
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