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TA克隆，連接轉(zhuǎn)化能長菌落，但是菌液PCR鑒定沒有結(jié)果 已有4人參與
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PCR擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，電泳檢測條帶單一，濃度為50ng/微升。 PCR產(chǎn)物和pMD 18-T 載體連接，連接體系是：PCR產(chǎn)物3.5微升，pMD 18-T vector 1微升，水0.5微升，Solution I 5微升。16℃連接3h，使用的是PCR儀器。 固體LB培養(yǎng)基配制：胰蛋白胨1g，酵母浸粉0.5g，氯化鈉1g，加水定容100ml，調(diào)節(jié)PH為7.5，高溫高壓滅菌30min，待溫度適宜，加入IPTG 20微升，X-gal 100微升，AMP 100微升，倒板。 10微升連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)入50微升大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，冰浴30min，42℃熱激90s，冰浴2min，加入700微升液體LB培養(yǎng)液，37℃恒溫搖床200rpm 1h，4000rpm離心5min，棄上清500微升，重懸浮，涂板，37℃過夜培養(yǎng)。我看有些人的實驗記錄都是12-14h就能挑菌了，但是我的12-15h內(nèi)很難看清藍白斑，我一般是等到16-18h之間才能很明顯分辨出藍白斑菌落，這時候才能挑白斑，于1ml 含1微升AMP的液體LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫搖床復蘇8h。 菌液PCR鑒定，10微升體系是：Taq酶0.05微升，buffer 1微升，dNTP 0.8微升，上游引物0.5微升，下游引物0.5微升，菌液1微升0.5微升0.3微升都有做過，加水至10微升。引物使用的是之前PCR擴增引物。反應(yīng)程序有所改變，95℃預(yù)變性時間從之前的5min變成15min。 挑單克隆菌落的時候，看著藍白斑菌落很明顯能分開，并且感覺長勢不錯，信心滿滿，但是菌液PCR怎么都沒有條帶，心都碎了。。。。crying 在半個月之前用同樣的方法，不同的基因克隆，還做的不錯，測序結(jié)果也挺好。 1、有人說插入片段和載體的比例，我算了一下，符合比例的范圍啊。 2、不是不長菌落，能區(qū)分藍白斑，只是時間久點，感覺長的還不錯。 3、菌液PCR做了梯度，還做了對照，酶等試劑沒有問題。 可是還找不到原因原因到底在哪啊。。。。老板不管你中間費了多少勁，沒有結(jié)果可不行啊。。。求小伙伴兒分析原因，相助  |
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【答案】應(yīng)助回帖
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lyzjc: 回帖置頂 2017-03-03 19:46:10
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lyzjc: 回帖置頂 2017-03-03 19:46:10
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謝謝各位回復。 經(jīng)自己的不斷重復摸索，成功連接了一個，并且成功測序。今天做的菌液PCR鑒定也成功擴增出陽性克隆，已送去測序。 1、克隆相關(guān)的試劑一個都沒有更換。 2、懷疑連接時間不夠，把連接時間增加到6h左右。 3、懷疑與菌液濃度有關(guān)，把搖菌所加液體LB培養(yǎng)基增加到4ml和2ml，且都有擴增成功。 我認為一般克隆不成功的原因，再排除操作手法的原因之后，最大可能得原因有兩點： 1、連接不成功 2、菌液PCR環(huán)節(jié)出了問題，最有可能就是菌液濃度。 希望給自己，也給大家一個經(jīng)驗參考。 |
15樓2016-10-13 19:46:39
781055707
木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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(16℃連接3h，使用的是PCR儀器。)我一直都是放保溫杯里，16℃過夜的，十次有8.9次成功。 別用藍白板篩選，別加IPTG，直接加AMP篩選。選他8個，8個沒有就不用在篩了。 最主要的還是pMD 18-T ，國產(chǎn)的往往今天能連上，一個星期后就連不上了，這個我還是用TAKARA的，小日本試劑的穩(wěn)定性還是可以的。 PCR時不要用高保真酶。 |
2樓2016-09-19 15:28:09
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4樓2016-09-21 15:44:27
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