 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 4542 | 回復(fù): 40 | |||
[求助]
TA克隆，連接轉(zhuǎn)化能長(zhǎng)菌落，但是菌液PCR鑒定沒有結(jié)果 已有4人參與
|
|||
|
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，電泳檢測(cè)條帶單一，濃度為50ng/微升。 PCR產(chǎn)物和pMD 18-T 載體連接，連接體系是：PCR產(chǎn)物3.5微升，pMD 18-T vector 1微升，水0.5微升，Solution I 5微升。16℃連接3h，使用的是PCR儀器。 固體LB培養(yǎng)基配制：胰蛋白胨1g，酵母浸粉0.5g，氯化鈉1g，加水定容100ml，調(diào)節(jié)PH為7.5，高溫高壓滅菌30min，待溫度適宜，加入IPTG 20微升，X-gal 100微升，AMP 100微升，倒板。 10微升連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)入50微升大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min，42℃熱激90s，冰浴2min，加入700微升液體LB培養(yǎng)液，37℃恒溫?fù)u床200rpm 1h，4000rpm離心5min，棄上清500微升，重懸浮，涂板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。我看有些人的實(shí)驗(yàn)記錄都是12-14h就能挑菌了，但是我的12-15h內(nèi)很難看清藍(lán)白斑，我一般是等到16-18h之間才能很明顯分辨出藍(lán)白斑菌落，這時(shí)候才能挑白斑，于1ml 含1微升AMP的液體LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫?fù)u床復(fù)蘇8h。 菌液PCR鑒定，10微升體系是：Taq酶0.05微升，buffer 1微升，dNTP 0.8微升，上游引物0.5微升，下游引物0.5微升，菌液1微升0.5微升0.3微升都有做過(guò)，加水至10微升。引物使用的是之前PCR擴(kuò)增引物。反應(yīng)程序有所改變，95℃預(yù)變性時(shí)間從之前的5min變成15min。 挑單克隆菌落的時(shí)候，看著藍(lán)白斑菌落很明顯能分開，并且感覺長(zhǎng)勢(shì)不錯(cuò)，信心滿滿，但是菌液PCR怎么都沒有條帶，心都碎了。。。。crying 在半個(gè)月之前用同樣的方法，不同的基因克隆，還做的不錯(cuò)，測(cè)序結(jié)果也挺好。 1、有人說(shuō)插入片段和載體的比例，我算了一下，符合比例的范圍啊。 2、不是不長(zhǎng)菌落，能區(qū)分藍(lán)白斑，只是時(shí)間久點(diǎn)，感覺長(zhǎng)的還不錯(cuò)。 3、菌液PCR做了梯度，還做了對(duì)照，酶等試劑沒有問(wèn)題。 可是還找不到原因原因到底在哪啊。。。。老板不管你中間費(fèi)了多少勁，沒有結(jié)果可不行啊。。。求小伙伴兒分析原因，相助  |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有292人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- TA克隆測(cè)序菌落PCR，時(shí)隔半年，換了載體試劑盒，還是150bp
已經(jīng)有16人回復(fù)
- SSH后建立cDNA文庫(kù)，挑的菌落太少？
已經(jīng)有2人回復(fù)
- 親們，關(guān)于TA克隆什么的，不是很理解
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 酶切，連接，轉(zhuǎn)化，已快崩潰
已經(jīng)有41人回復(fù)
- 求助：圖片為菌液PCR后的結(jié)果，送測(cè)序的話可以得到滿意的結(jié)果嗎
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 克隆，轉(zhuǎn)化，全長(zhǎng)cDNA克隆，表達(dá)目的蛋白。PMD18-
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 【專題】基因克隆知識(shí)問(wèn)答及FAQ
已經(jīng)有0人回復(fù)
【答案】應(yīng)助回帖
★
xn8008: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-10-14 09:44:32
xn8008: 應(yīng)助指數(shù)+1 2016-10-14 09:44:49
lyzjc: 回帖置頂 2017-03-03 19:46:10
xn8008: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-10-14 09:44:32
xn8008: 應(yīng)助指數(shù)+1 2016-10-14 09:44:49
lyzjc: 回帖置頂 2017-03-03 19:46:10
|
謝謝各位回復(fù)。 經(jīng)自己的不斷重復(fù)摸索，成功連接了一個(gè)，并且成功測(cè)序。今天做的菌液PCR鑒定也成功擴(kuò)增出陽(yáng)性克隆，已送去測(cè)序。 1、克隆相關(guān)的試劑一個(gè)都沒有更換。 2、懷疑連接時(shí)間不夠，把連接時(shí)間增加到6h左右。 3、懷疑與菌液濃度有關(guān)，把搖菌所加液體LB培養(yǎng)基增加到4ml和2ml，且都有擴(kuò)增成功。 我認(rèn)為一般克隆不成功的原因，再排除操作手法的原因之后，最大可能得原因有兩點(diǎn)： 1、連接不成功 2、菌液PCR環(huán)節(jié)出了問(wèn)題，最有可能就是菌液濃度。 希望給自己，也給大家一個(gè)經(jīng)驗(yàn)參考。 |
15樓2016-10-13 19:46:39
781055707
木蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 291 (大學(xué)生)
- 金幣: 3118.2
- 散金: 46
- 紅花: 19
- 帖子: 2030
- 在線: 579.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 3046113
- 注冊(cè): 2014-03-13
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-09-19 21:28:30
xn8008: 應(yīng)助指數(shù)+1 2016-10-14 09:42:15
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-09-19 21:28:30
xn8008: 應(yīng)助指數(shù)+1 2016-10-14 09:42:15
|
(16℃連接3h，使用的是PCR儀器。)我一直都是放保溫杯里，16℃過(guò)夜的，十次有8.9次成功。 別用藍(lán)白板篩選，別加IPTG，直接加AMP篩選。選他8個(gè)，8個(gè)沒有就不用在篩了。 最主要的還是pMD 18-T ，國(guó)產(chǎn)的往往今天能連上，一個(gè)星期后就連不上了，這個(gè)我還是用TAKARA的，小日本試劑的穩(wěn)定性還是可以的。 PCR時(shí)不要用高保真酶。 |
2樓2016-09-19 15:28:09
10樓2016-10-01 08:13:36
3樓2016-09-19 17:46:48
4樓2016-09-21 15:44:27
5樓2016-09-28 17:01:36
6樓2016-09-28 18:56:26
小冀-
版主 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 713 (博后)
- 貴賓: 3.033
- 金幣: 11446.9
- 散金: 1055
- 紅花: 82
- 帖子: 2509
- 在線: 445.9小時(shí)
- 蟲號(hào): 1521695
- 注冊(cè): 2011-12-03
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物信息學(xué)
- 管轄: 微生物
【答案】應(yīng)助回帖
★
xn8008: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-10-14 09:43:01
xn8008: 應(yīng)助指數(shù)+1 2016-10-14 09:43:15
xn8008: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-10-14 09:43:01
xn8008: 應(yīng)助指數(shù)+1 2016-10-14 09:43:15
|
菌長(zhǎng)出來(lái)了，應(yīng)該不是轉(zhuǎn)化的問(wèn)題，考慮是不是載體問(wèn)題，會(huì)不會(huì)自連了，我們用19t，有時(shí)候假陽(yáng)性特別多，p不出來(lái)，后來(lái)酶切發(fā)現(xiàn)全都自連的，后來(lái)?yè)Q個(gè)批次就好了 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2016-09-28 23:54:20
8樓2016-10-01 08:08:29
9樓2016-10-01 08:11:31
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 lyzjc 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +8 | 妮妮ninicgb 2026-03-15 | 12/600 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 材料工程專碩調(diào)劑 +5 | 204818@lcx 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 324分 +8 | llllkkkhh 2026-03-18 | 8/400 |
|
|
[考研] 267一志愿南京工業(yè)大學(xué)0817化工求調(diào)劑 +8 | SUICHILD 2026-03-12 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +11 | 冬十三 2026-03-15 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +3 | 妮妮ninicgb 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +3 | 冷笙123 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料與化工求調(diào)劑 +6 | 為學(xué)666 2026-03-16 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 梁成偉老師課題組歡迎你的加入 +8 | 一鴨鴨喲 2026-03-14 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 274求調(diào)劑 +5 | 時(shí)間點(diǎn) 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] [導(dǎo)師推薦]西南科技大學(xué)國(guó)防/材料導(dǎo)師推薦 +3 | 尖角小荷 2026-03-16 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +3 | 文思客 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0854控制工程 359求調(diào)劑 可跨專業(yè) +3 | 626776879 2026-03-14 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 0856求調(diào)劑 +3 | 劉夢(mèng)微 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 255求調(diào)劑 +3 | 李嘉慧， 2026-03-12 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料工程調(diào)劑 +9 | 咪咪空空 2026-03-12 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 工科材料085601 279求調(diào)劑 +8 | 困于星晨 2026-03-12 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 材料301分求調(diào)劑 +5 | Liyouyumairs 2026-03-12 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +3 | 是Lupa啊 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +3 | 152697 2026-03-12 | 4/200 |
|